DB37_T 3531-2019 羊奶中羊、大豆源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法.docx
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1、ICS67.100.01X16DB37山东省地方标准DB37/T35312019羊奶中羊、大豆源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法Identificationofcaprine,sheepandglycinederivedmaterialsingoatorsheepmilkReal-timefluorescentPCRmethod2019-03-21发布2019-04-21实施山东省市场监督管理局发布DB37/T35312019目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15试剂和材料.15.1试剂.25.2材料.26仪器设备.27检测用引物和探针.38试验步骤.38
2、.1取样.38.2DNA提取.38.3实时荧光PCR反应.39试验数据处理.49.1PCR有效性判定.49.2检测结果分析和表述.410检测过程中防止交叉污染的措施.4附录A(规范性附录)实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定.5附录B(资料性附录)目的基因扩增靶标参考序列.7IDB37/T35312019前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东省农业科学院生物技术研究中心。本标准主要起草人:张全芳、范阳阳、刘艳艳、胡悦、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、王俊燕、步迅
3、。IIDB37/T35312019羊奶中羊、大豆源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法1范围本标准规定了羊奶产品中羊、大豆源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。本标准适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、大豆源性成分的定性检测。本方法的检出限为0.1%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1羊源性本标准提
4、及的羊源性成分为山羊和绵羊。3.2实时荧光PCRreal-timefluorescencePCR在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程,对未知模板进行定性或定量分析。3.3Ct值cyclethreshold每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理以山羊和绵羊线粒体16SrDNA,大豆内源基因Lectin为靶基因,在不同物种间保守区设计通用引物,在可变区设计物种特异性探针,采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增,根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值,判定羊和大豆的源性成分。5试剂和材料1DB37/T35312019除非另有说
5、明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1氯化钠(NaCl)。5.1.2浓盐酸(HCl)。5.1.3三羟甲基氨基甲烷(Trisbase)。5.1.4二水乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA2H2O)。5.1.5十二烷基硫酸钠(SDS)。5.1.6磷酸盐缓冲液(PBS)。5.1.7异硫氰酸胍(GuSCN)。5.1.8硅珠(silica)。5.1.9蛋白酶冻干品。5.1.10聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)。5.1.11无水乙醇。5.1.12Chelex-100树脂。5.2材料5.2.1生理盐水:称取0.85g氯化钠加20mL水溶解,转移至
6、100mL容量瓶中,加水定容至刻度,103.4KPa蒸汽压(121)灭菌20min,降至室温,4保存备用。5.2.220mg/mL蛋白酶K溶液:称取0.2g蛋白酶冻干品,转移至10mL容量瓶中,加水定容至刻度,分装后于-20保存。5.2.35%的Chelex-100:称取5gChelex-100树脂,转移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度。5.2.41mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液:称取12.1g三羟甲基氨基甲烷置于100mL烧杯中,加入80mL水,用浓盐酸调节pH至6.4,转移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度,103.4KPa蒸汽压(121)灭菌20min,室温保存待用。
7、5.2.50.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液:称取18.61g二水乙二胺四乙酸二钠置于100mL烧杯中,加入80mL水,用10%的氢氧化钠溶液,调节pH至8.0,转移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度,103.4KPa蒸汽压(121)灭菌20min,室温保存待用。5.2.610%SDS:称取10g十二烷基硫酸钠溶解于80mL无菌水中,转移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度,储存于灭菌过的容器中待用。5.2.7DNA结合液:称取60g异硫氰酸胍,加入5mL1mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液,再加入8mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(pH8.0)溶液,再加入4mL聚乙二
8、醇辛基苯基醚原液(温度60),转移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度。5.2.8TE缓冲液:将0.5mL的10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、0.1mL的0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(pH8.0)加入到50mL的容量瓶中,调节pH至8.0,转移至50mL容量瓶中,加水定容至刻度,103.4KPa蒸汽压(121)灭菌20min,降至室温,4保存备用。6仪器设备6.1实时荧光定量PCR仪:4通道以上。6.2电子分析天平:感量0.1mg。6.3离心机:最大离心力不小于13000g。6.4振荡型恒温金属浴:0100。2DB37/T353120196.5高压灭菌锅。6.6低温冰箱:-2
9、04。6.7超净工作台。6.8微量移液器:100L1000L,10L200L,2L20L,0.5L10L。6.9容量瓶:10mL,50mL,100mL。7检测用引物和探针内标引物探针序列及羊和大豆的引物和特异性探针序列见附录A中表A.1。引物探针在序列中的位置参见附录B。8试验步骤8.1取样首先收集白细胞:取液态羊奶2mL,或者奶粉20mg溶于2ml无菌水中,每个样品设立2个平行样,将样品于4、2500g离心30min;弃去离心管的上层乳脂和中间层乳液,保留其底部沉淀,向底部加lmLpH7.4灭菌的PBS缓冲液,将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5mL的离心管中,离心力3500g,常温离心10mi
10、n,弃去上层液体,保留底部沉淀。8.2DNA提取8.2.1向收集的白细胞中加入280L5%的Chelex-100和20L20mg/ml蛋白酶K,56保温30min以上;高速震荡5s10s,100煮沸8min;高速震荡5s10s,13000g离心3min,转移上清液至离心柱中,13000g离心1min,收集上清液。8.2.2向收集液体中加入20L硅珠悬浮液和600LDNA结合液,充分混匀,65水浴15min,中间反转35次;室温放置5min,中间反转35次;4000g离心1min,弃上清,留管底沉淀。8.2.3加入500L70%乙醇,于8000g离心1min,重复此步骤2次;加入500L无水乙醇
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