保健食品中巴比妥类化学成分的快速检测胶体金免疫层析法.doc

0附件 3保健食品中巴比妥类化学成分的快速检测胶体金免疫层析法（征求意见稿）1 范围本方法规定了保健食品中巴比妥类化学成分的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于硬胶囊、软胶囊、丸剂、片剂、散剂及口服液等保健食品中巴比妥类化 学成分的快速测定。2 原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的巴比妥类化学成分经提取后与胶体金标 记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测线（T 线）上抗原的结合，从而致使检测线不显 色。通过检测线的显色与否判读，对样品中巴比妥类化学成分进行定性判定。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 无水乙醇。3.1.2 提取液：将无水乙醇（3.1.1）与水按照体积比 10:90 混匀。 3.1.3 甲醇。 3.2 参考物质参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量见表 1，纯度95%。表 1 参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS 登录号分子式相对分子量巴比妥Barbital57-44-3C8H12N2O3184.19苯巴比妥Phenobarbital50-06-6C12H12N2O3232.24异戊巴比妥Amobarbital57-43-2C11H18N2O3226.27司可巴比妥钠Secobarbital76-73-3C12H17N2O3238.28注：或等同可溯源物质。3.3 标准溶液的配制3.3.1 巴比妥类标准储备液（0.5 mg/mL）：精密称取巴比妥（或苯巴比妥，异戊巴比妥， 司可巴比妥钠）标准品（3.2.1）适量，置于 10mL 容量瓶中，加入适量甲醇（3.1.3）超声1溶解后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 0.5mg/mL 的巴比妥类标准储备液。20 避光保存，有效期 6 个月。 3.3.2 巴比妥类标准中间液（50g/mL）：精密量取巴比妥类标准储备液（0.5mg/mL） （3.3.1）1mL，置于 10mL 容量瓶中，用甲醇（3.1.3）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 50g/mL 的巴比妥类标准中间液。3.4 材料免疫胶体金免疫层析试剂盒，适用于保健食品硬胶囊、软胶囊、丸剂、片剂、散剂及 口服液。4 仪器和设备4.1 天平：感量为 0.01 g。 4.2 涡旋混合器。 4.3 移液器：200L 4.4 离心机：转速4000r/min。 4.5 环境条件：温度 1535，湿度80%。5 分析步骤5.1 试样制备取适量样品，硬胶囊及软胶囊取内容物充分混匀，丸剂及片剂充分粉碎混匀，散剂及 口服液充分混匀。5.2 试样提取准确称取试样 2.0 g（精确至 0.01g）于 15mL 具塞离心管中，加入 10mL 提取剂 （3.1.2） 。加盖后振摇或涡旋振荡 0.5min，放置至澄清（30min 内）或 4000r/min 离心 5min，取上清液作为待测液。5.3 测定步骤吸取 200 L 待测液滴加到检测卡（3.4.1.1）上的加样孔中，开始计时。38min 内观 察质控线（C 线）和检测线（T 线）的显色情况，进行结果判定。5.4 质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1 空白试验 称取空白试样，按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法操作。 5.4.2 加标质控试验 准确称取空白试样（精确至 0.01g）置于 15mL 具塞离心管中，加入一定体积的巴比妥 类标准中间液（3.3.2） ，使巴比妥类化学成分添加浓度为：巴比妥 40mg/kg（或苯巴比妥 40mg/kg，异戊巴比妥 60mg/kg，司可巴比妥钠 60mg/kg） 。按照 5.2 和 5.3 步骤与样品同法 操作。6 结果判定通过对比控制线（C 线）和检测线（T 线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意 图见图 1。 6.1 无效2控制线（C 线）不显色，表明不正确操作或检测卡无效。 6.2 阴性结果 检测线（T 线）和控制线（C 线）均显色，表明样品中巴比妥类化学成分低于方法检 测限，判定为阴性。 6.3 阳性结果 检测线（T 线）不显色，控制线（C 线）显色，表明样品中巴比妥类化学成分的含量 高于方法检测限，判定为阳性。C TC TC TC TC TC T阴性（-） 阳性（） 无效图 1 检测结果判读6.4 质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。7 结论当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。8 性能指标8.1 检测限：巴比妥 40mg/kg、苯巴比妥 40mg/kg、异戊巴比妥 60mg/kg、司可巴比妥钠 60mg/kg。 8.2 灵敏度：灵敏度应96%。 8.3 特异性：特异性应98%。 8.4 假阴性率：假阴性率应4%。 8.5 假阳性率：假阳性率应2%。 8.6 相对准确度：相对准确度应96%。注：性能指标计算方法见附录 A。9 其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法 时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满 足本方法规定的各项性能指标。 本方法参比标准为国家食品药品监督管理总局药品检验补充检验方法和检验项目批 准件（批准件编号 2009024） 和保健食品中 75 种非法添加化学药物的检测 BJS 201710 。3附录 A定性方法性能计算表表 A.1 性能指标计算方法检测结果b 样品情况a 阳性阴性总数阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2显著性差异(2)2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf- ，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率 （pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行， 第一列，N1.表示所有的第一行，N.2 表示所有的第二列；N12 表示第一行，第二列。c为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。 验证单位：山东省食品药品检验研究院、河北省药品检验研究院。 主要起草人：王子龙、董培智、裴晓芬、杨国伟、刘春霖、马春艳。