口服脊髓灰质炎活疫苗制造及检定规程.doc

口服脊髓灰质炎活疫苗制造及检定规程口服脊髓灰质炎活疫苗制造及检定规程口服脊髓灰质炎活疫苗系用具有高度抗原性的脊髓灰质炎、型减毒株，分别接种于猴肾或人二倍体细胞培养制成的单价或三价液体疫苗。用于预防脊髓灰质炎。A A、猴肾细胞脊髓灰质炎活疫苗、猴肾细胞脊髓灰质炎活疫苗1 1 毒种毒种1.1 毒种来源可用 Sabin 株，Sabin 纯化株，中17，中2 株。所有疫苗生产用毒株均须经卫生部批准。1.2 毒种批1.2.1 毒种批制备与保存毒种批用原毒株在猴肾细胞或人二倍体细胞上制备。从原毒株算起，Sabin、型、中17 及中2 型传代次数均不得超过 3 代，Sabin型不超过 2 代。所有毒种均应于-60以下保存。1.2.2 毒种批检定每一毒种批均按 A3 项分批检定（滴度不得低于6.5LogPFU/1.0ml）。2 2 疫苗制备疫苗制备生产用房应为独立的单元，不得携入或操作强毒株或其他病毒、致病菌。生产前，应对生产区进行消毒。工作人员必须经过专业培训，身体健康，并服用脊髓灰质炎活疫苗。每年生产前应进行体检。传染性肝炎、痢疾、活动性肺结核患者不得进入生产部门。在猴区工作的人员不得患有肺结核。2.1 猴肾细胞制备2.1.1 动物选择和检疫用未做过其他试验或做过本疫苗检定的健康猕猴制备细胞培养物。所用动物隔离检疫应不少于 6 周，应无结核、B 病毒感染及其他急性传染病。凡有严重化脓灶、赘生物以及明显的肝、肾病理改变者不得用于制备疫苗。2.1.2 细胞消化与培养采用电磁搅拌或灌注法以胰蛋白酶或其他分散剂消化猴肾细胞。细胞培养瓶置 37±0.5培养，应于 9 天内长成单层。每只猴所获细胞为一个细胞批。可把原代猴肾细胞连续传 5 代后，用于接种病毒。2.2 病毒接种、培育与收集细胞维持液含 3.05.0g/L 碳酸氢钠（pH7.67.8）。病毒接种量为 0.010.5MOI，种毒后置 33±0.5培养，出现完全病变时间应在 4096 小时。病毒液按细胞批收集于大瓶中，澄清过滤。2.3 病毒液合并或浓缩病毒液合并或浓缩时可用 0.2m 的滤膜过滤。2.4 加氯化镁与分批病毒液加氯化镁，最终浓度为 1mol/L（pH6.87.2）即为液体疫 苗。同日制备的病毒液为一个亚批，数个亚批组成一个疫苗批，批量一般不超过 40 万 ml。2.5 分装半成品经检定合格后分装即为液体疫苗成品。3 3 检定检定3.1 猴肾细胞外源因子检查3.1.1 对照细胞检查于接种病毒当天（0 天），每批猴肾细胞留取 10%25%换维持液，作为正常细胞对照，以检查外源因子。该细胞瓶置 3335培育，观察 14 天，以此期间检查细胞病变。有疑似病毒存在者，用猴肾细胞传代，传代后仍有类似现象，该细胞批所制疫苗应废弃。用于传代的猴肾细胞应设细胞对照。3.1.2 血吸附检查种毒后 7 天，检查对照细胞中血吸附病毒。通常用0.2%0.5%鸡、豚鼠红细胞（储存于 28不超过 7 天），分别放 48、202530 分钟观察结果，应为阴性。如血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。3.1.3SV40 及其他外源因子检查当日生产猴肾细胞批同时接种小方瓶数个做外源因子检查，于种毒 02 天，将细胞上清混合液接种于对 SV40 病毒敏感的Vero 细胞瓶中，混合液在培养液中的含量应不少于 20%，同种细胞最少留一瓶以上不接种，作为细胞对照，观察 14 天。于接种后 58 天，再把上述细胞培养的上清液盲传一代，传代后观察 14 天。3.2 病毒液检查3.2.1 外源因子检查样品以脊髓灰质炎病毒型特异性抗体（该抗体不能用猴制备，免疫用抗原必须用非灵长类细胞制备）或单克隆抗体中和。中和物（可稀释，但稀释度不应超过 14）接种猴肾细胞或其他已知对 SV40 敏感的细胞，并留取正常细胞对照，37培养观察 4 周。观察到 2 周时，用同样细胞再传一代，并观察 2 周。观察期满因其他原因剔除不能观察的细胞瓶数不大于 20%，本试验为成立。如培养物发生病变，应查清原因。如证实该病变是由于未中和的脊髓灰质炎病毒引起的则须重试。如证实病变确系 SV40 或其他外源因子污染所致，并证明与病毒液有关，则该批病毒液应废弃。3.2.2 无菌试验及支原体检查按生物制品无菌试验规程进行。支原体检查使用已证实支持需固醇和非需固醇支原体生长的液体和固体两种培养基。3.2.3 病毒滴定用微量细胞病变法或空斑法在猴肾或 Hep-2 或其他敏感细胞上进行。培养温度为 3536，病变法 7 天判定结果，空斑法 4 天判定结果。病毒滴定时应设病毒参考品。3.2.4 型特异性检定取、型单价或三价脊髓灰质炎病毒抗血清与等量样品混合，置 37中和 1 小时，接种猴肾、Hep-2 或其他敏感细胞，7 天判定结果。样品应为单价病毒液，型别正确无误。3.2.5 家兔试验经 3.2.13.2.4 项检定合格的样品，每瓶等量取样合并。如果不立即进行检定，样品应保存于-20以下。样品应进行猕猴疱疹病毒（B 病毒）和其他病毒检查。用体重为 1.52.5kg 的健康家兔最少 5 只，每只家兔注射的样品量不少于 10ml，用其中 1ml 进行皮内多点注射，其余的进行皮下注射，观察时间不少于 3 周。到期动物死亡数不得超过20%。无 B 病毒和其他病毒感染判为合格。家兔在试验 24 小时以后死亡，疑有 B 病毒感染时作尸体解剖检查，取部分神经组织及脏器标本冻存待查。同时用脑细胞制成 10%悬液，以同样方法接种 5 只家兔，证实有 B 病毒感染时，应终止生产并报告国家检定当局，未采取措施防止再感染之前，不得继续生产。3.2.6 猴体试验猴体神经毒力试验可采用脊髓注射或脑内注射方法。应使用健康猕猴，体重在 1.5kg 以上并应符合 2.1.1 项规定。猴血清经 14 稀释后应证明不含同型病毒中和抗体。3.2.6.1 脊髓法（1）猴的数量疫苗猴体试验必须设立参考制品。评价、型疫苗及其参考制品最少应各有 11 只有效猴，评价型疫苗应至少有 18只有效猴。数个亚批疫苗可合并作一个疫苗批进行猴体试验，疫苗量一般不超过 40 万 ml。猴子的大小和性别应承受机分配各组。同型参考制品可用于测试一批以上疫苗。有效猴系指在中枢神经系统看到脊髓灰质炎病毒引起的特异性神经元损伤的猴子。有效猴数不足时，允许补足，但也应同时设有参考猴数。如试验需要 2 个工作日，则每一个工作日用疫苗和同型参考制品接种的猴子数应相等。为了得到 11 只和 18 只有效猴，通常要相应地增加接种猴数。（2）疫苗和参考制品的病毒滴度疫苗和同型参考制品的病毒含量应调整到尽可能接近，每只猴注射 6.57.5LogCCID50/1.0ml，但只用一个病毒浓度接种动物。（3）试验观察全部猴子应观察 1722 天。在接种 24 小时后死亡猴应作尸体解剖，检查是否因脊髓灰质炎引起的死亡。因其他原因死亡的猴子在判定时可以剔除。在观察期内死亡的猴数不超过 20%时，试验为成立。呈濒死状态或严重麻痹的猴子应处死进行尸检。（4）检查切片数每只猴子取中枢神经系统进行组织学检查。切片厚度为1015m，没食子蓝染色检查切片数如下：腰膨大 12 个切面；颈膨大 10 个切面；延髓 2 个切面；桥脑和小脑各 1 个切面；中脑 1 个切面；大脑皮层左右侧和丘脑各 1 个切面。（5）病毒活性的计分为了评价脑和脊髓半个切面的病毒活性，由同一人员统一采用 4 级计分法判断其病变严重程度。（一）仅有细胞浸润（这不足以认为是有效猴）；（二）细胞浸润伴有少量的神经元损害；（三）细胞浸润伴有广泛的神经元损害；（四）大量的神经元损害，伴有或无细胞浸润。切片中有神经元损害，但未见针迹者应视为有效猴。切片中由外伤引起的损害，而又无特异的病理改变则不视为有效猴。严重程度的分值是由腰髓、颈髓和脑组织切片的整个切片的计分累计而成的。每只有效猴的病变分值为：Ls=腰髓分值总和/半个切片数+颈髓分值总和/半个切片数+脑分值总和/半个切片数÷3再计算每组有效猴的平均分值。（6）神经毒力试验的评价。参考制品的平均病变分值在上限与下限之间时，各生产单位才能根据各自的 C1、C2、C3 值判定疫苗合格与否，判定标准如下：疫苗的平均病变分值（Xtest）与参考制品的平均病变分值（Xref）想比较。合格：Xtest-XrefC1不合格：Xtest-xrefC2重试：（1）C1Xrest-XrefC2（仅限一次）；（2）同一次试验中，疫苗组平均分值与参考组平均分值之差小于 C1 时，而疫苗组中单只猴最高分值2.5，并大于疫苗参考组单只猴最高分值的两倍时，本批疫苗应重试。重试合格：X（test1+test2）-X（ref1+ref2）/2C3重试不合格：X（test1+test2）-X（ref1+ref2）/2C33.2.6.2 脑内法取健康猴 20 只，麻醉后在两侧视丘分别注入 0.5ml 样品，不低于 7.0LogPFU/1.0ml 及 10-1各 10 只，观察 21 天。到期动物死亡数和未命中数不得超过 20%，否则应补足。注射后 48小时内死亡或出现非特异性麻痹症状者剔除不计。中途死亡及到期处死动物，做中枢神经系统病理组织学检查，判定标准如下：合格标准：凡符合下列情况之一判为合格：（1）中枢神经系统无脊髓灰质炎病理组织学改变；（2）有 2 只猴发生轻度及其以下病变；（3）1 只猴发生中度及其以下病变。不合格标准：（1）一只猴有中度病变，同时一只猴有轻度以上病变者；（2）一只猴有重度以上病变者。重试标准：2 个亚批疫苗合并试验结果不合格者，可以分批重试，并按上述标准判定。3.2.7rct 特征试验将单价病毒液分别在 36及 40温度条件下进行病毒滴定，培养温度差不超过±0.1，试验设 t+和 t-样品（生产毒种或已知对人安全的疫苗）为对照。如果被试病毒液和参考病毒在36的繁殖滴度比 40的滴度高 5.0Log，则 rct 特征试验合格。此外，也可进行 d 特征试验，以弥补 rct 特征试验的不足。3.3 成品检定3.3.1 外观检查疫苗应为橘红色液体，澄清无异物。3.3.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.3.3 病毒滴定与 3.2.3 项相同。每人份三价疫苗病毒含量（LogCCID50或 PFU/1.0ml）应6.15,型 6.0，型 5.0，型 5.5。单价应5.0。3.3.4 热稳性定试验疫苗批样品于 37放置 48 小时，病毒滴度降低不得超过0.5Log。4 4 保存与效期保存与效期于-20以下保存，自病毒滴定合格之日起效期为 2 年。28保存效期为 1 年。