实验六PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测.ppt

实验六 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测,常祖明,实验目的,1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理 2.学会琼脂糖凝胶的制作和进行电泳的方法,实验原理,1.DNA琼脂糖凝胶电泳的原理,琼脂糖是一种线性多糖聚合物，天然聚合长链状分子，在沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小取决于琼脂糖的浓度，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。,实验原理,（1）电荷效应 DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电泳时向阳极移动。,（2）分子筛效益 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决于分子筛效益，即DNA分子本身的大小和构象（共价闭环DNA线状DNA开环DNA），而且其迁移速度与其相对分子质量的对数值成反比，所以不用相对分子质量的DNA分子可以在琼脂糖凝胶电泳中分离。,2. DNA分子进行染色的原理（以溴化乙锭为例）,观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分子。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的荧光要比单纯的DNA分子要强的多，便于DNA的检测。,实验仪器、材料、试剂,实验仪器及用具 电泳仪、移液枪、电磁炉、锥形瓶、容量瓶、紫外分析仪 实验材料及试剂 实验材料：鸡血DNAPCR扩增产物 DNA Marker 、GoldView核酸染色剂 、琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris） 、硼酸 、乙二胺四乙酸二钠、 6DNA LodingBuffer 实验试剂：0.5TBE（PH8.0）缓冲液 、1.0%琼脂糖溶液、,实验步骤,琼脂糖凝胶的配制,1g琼脂糖,100mlTBE缓冲液,5l GoldView,冷却到60,1.将适量的DNA Marker用移液枪加入凝胶的第一个孔中。 2.在PCR产物中加入6DNA LodingBuffer（每5ul产物加入1ul），混匀后，用移液枪加入到样品孔内，每孔加2ul。,点样,肉眼可见指示剂泳至距制胶板前端约2-3cm处即可停止电泳。切断电源，取出凝胶，置于紫外线透射仪上观察电泳结果，或用凝胶成像分析系统拍照保存。,电泳、观察,注意事项,1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。 2. 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。 3. 操作过程必须戴手套操作，严格注意防护。 4. 加样时，Tip 头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA 带型不整齐。 5. 电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。 6. 电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。将两者混匀后加入点样孔，注意枪头尽量往下，同时防止气泡产生。,讨论,影响DNA迁移速率的因素有哪些？,