保健食品功能检验与评价方法（2022年版）.doc

附件 3保健食品功能检验与评价方法（2022 年版）适适用用范范围围1 保健功能检验与评价应符合保健食品功能检验与评价技术指导原则（2022 年版） 。2 保健功能检验与评价方法仅作为推荐性方法，不作为强制性方法。针对已纳入功能目录的保健功能新的评价方法，参照保健功能目录的纳入程序，认可作为保健功能检验与评价的推荐性方法后，可注册使用。目 录第一部分、保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定1 一、有助于增强免疫力1 二、有助于抗氧化1 三、辅助改善记忆2 四、缓解视觉疲劳3 五、清咽润喉3 六、有助于改善睡眠4 七、缓解体力疲劳4 八、耐缺氧5 九、有助于控制体内脂肪5 十、有助于改善骨密度6 十一、改善缺铁性贫血7 十二、有助于改善痤疮7 十三、有助于改善黄褐斑8 十四、有助于改善皮肤水份状况8 十五、有助于调节肠道菌群9 十六、有助于消化10 十七、有助于润肠通便11 十八、辅助保护胃粘膜11 十九、有助于维持血脂（胆固醇/甘油三酯）健康水平.12 二十、有助于维持血糖健康水平14 二十一、有助于维持血压健康水平15 二十二、对化学性肝损伤有辅助保护作用15 二十三、对电离辐射危害有辅助保护作用16 二十四、有助于排铅17第二部分 功能学检验方法.18 一、有助于增强免疫力检验方法18 二、有助于抗氧化检验方法31 三、辅助改善记忆检验方法52 四、缓解视觉疲劳检验方法63 五、清咽润喉检验方法67 六、有助于改善睡眠检验方法72 七、缓解体力疲劳检验方法75 八、耐缺氧检验方法81 九、有助于控制体内脂肪检验方法84 十、有助于改善骨密度检验方法88 十一、改善缺铁性贫血检验方法96 十二、有助于改善痤疮检验方法107 十三、有助于改善黄褐斑检验方法109 十四、有助于改善皮肤水份状况检验方法111 十五、有助于调节肠道菌群检验方法113 十六、有助于消化检验方法119 十七、有助于润肠通便检验方法124 十八、辅助保护胃粘膜检验方法128 十九、有助于维持血脂（胆固醇/甘油三酯）健康水平检验方法.132 二十、有助于维持血糖健康水平检验方法137 二十一、有助于维持血压健康水平检验方法146 二十二、对化学性肝损伤有辅助保护作用检验方法149 二十三、对电离辐射危害有辅助保护作用检验方法156 二十四、有助于排铅检验方法164 - 1 -第一部分、保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定1 有助于增强免疫力1.1 试验项目试验项目1.1.1 体重1.1.2 脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值1.1.3 细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4 体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5 单核巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验1.1.6 NK 细胞活性测定1.2 试验原则试验原则1.2.1 所列指标均为必做项目。1.2.2 采用正常或免疫功能低下的模型动物进行实验。1.3 结果判定结果判定有助于增强免疫力判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能、NK 细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有有助于增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核巨噬细胞功能结果阳性。NK 细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定 NK 细胞活性结果阳性。2 有助于抗氧化2.1 试验项目试验项目2.1.1 动物实验2.1.1.1 体重2.1.1.2 脂质氧化产物：丙二醛或血清 8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）2.1.1.3 蛋白质氧化产物：蛋白质羰基2.1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶2.1.1.5 抗氧化物质：还原型谷胱甘肽2.1.2 人体试食试验2.1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清 8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）2.1.2.2 超氧化物歧化酶- 2 -2.1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶2.2 试验原则试验原则2.2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。2.2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清 8-表氢氧-异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。2.2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。2.2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。2.3 结果判定结果判定2.3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品有助于抗氧化动物实验结果阳性。2.3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有有助于抗氧化的作用。3 辅助改善记忆3.1 试验项目试验项目3.1.1 动物实验3.1.1.1 体重3.1.1.2 跳台实验3.1.1.3 避暗实验3.1.1.4 穿梭箱实验3.1.1.5 水迷宫实验3.1.2 人体试食试验3.1.2.1 指向记忆3.1.2.2 联想学习3.1.2.3 图象自由回忆3.1.2.4 无意义图形再认3.1.2.5 人像特点联系回忆3.1.2.6 记忆商3.2 试验原则试验原则3.2.1 动物实验和人体试食试验为必做项目。3.2.2 跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验、水迷宫实验四项动物实验中至少应选三项，以保证实验结果的可靠性。3.2.3 正常动物与记忆障碍模型动物任选其一。3.2.4 动物实验应重复一次（重新饲养动物，重复所做实验） 。3.2.5 人体试食试验统一使用临床记忆量表。- 3 -3.2.6 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3.3 结果判定结果判定3.3.1 动物实验：跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验、水迷宫实验四项实验中任二项实验结果阳性。且重复实验结果一致（所重复的同一项实验两次结果均为阳性） ，可以判定该受试样品辅助改善记忆动物实验结果阳性。3.3.2 人体试食试验：记忆商结果阳性，可判定该受试样品具有辅助改善记忆的作用。4 缓解视觉疲劳4.1 人体试食试验项目人体试食试验项目4.1.1 分别于试食前后进行眼部症状及眼底检查，血、尿常规检查，肝、肾功能检查，症状询问、用眼情况调查；于试验前进行一次胸片、心电图、腹部 B 超检查。4.1.2 明视持久度 4.1.3 视力 4.2 试验原则试验原则 4.2.1 受试样品试食时间为 30 天，必要时可延长至 60 天。4.2.2 所列指标均为必做项目。4.2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 4.3 结果判定结果判定 4.3.1 试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，症状改善有效率且症状总积分差异有显著性（P0.05） 。4.3.2 试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，明视持久度差异有显著性（P0.05） ，且平均明视持久度提高大于等于 10%。具备4.3.1及4.3.2可判定该受试物具有缓解视觉疲劳功能。5 清咽润喉5.1 试验项目试验项目5.1.1 动物实验5.1.1.1 体重 5.1.1.2 大鼠棉球植入实验5.1.1.3 大鼠足趾肿胀实验5.1.1.4 小鼠耳肿胀实验5.1.2 人体试食试验：咽部症状、体征5.2 试验原则试验原则5.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。5.2.2 应对临床症状、体征进行观察。- 4 -5.2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。5.3 结果判定结果判定5.3.1 动物实验：大鼠棉球植入实验结果阳性，同时大鼠足趾肿胀实验或小鼠耳肿胀实验结果任意一项阳性，可判定该受试样品清咽润喉动物实验结果为阳性。5.3.2 人体试食试验：试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，咽部症状及体征有明显改善，症状及体征的改善率明显增加，可判定该受试样品具有清咽润喉。6 有助于改善睡眠6.1 试验项目试验项目6.1.1 体重6.1.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验6.1.3 戊巴比妥钠（或巴比妥钠）阈下剂量催眠实验6.1.4 巴比妥钠睡眠潜伏期实验 6.2 试验原则试验原则6.2.1 所列指标均为必做项目。6.2.2 需观察受试样品对动物直接睡眠的作用。6.3 结果判定结果判定延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠 （或巴比妥钠）阈下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验三项实验中任二项阳性，且无明显直接睡眠作用，可判定该受试样品具有有助于改善睡眠的作用。7 缓解体力疲劳7.1 实验项目实验项目 7.1.1 动物体重7.1.2 负重游泳实验7.1.3 血乳酸 7.1.4 血清尿素7.1.5 肝糖原或肌糖原7.2 试验原则试验原则7.2.1 动物实验所列指标均为必做项目。7.2.2 实验前必须对同批受试样品进行违禁药物的检测。7.2.3 运动实验与生化指标检测相结合。7.3 结果判定结果判定- 5 -负重游泳实验结果阳性，血乳酸、血清尿素、肝糖原/肌糖原三项生化指标中任二项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解体力疲劳的作用。8 耐缺氧8.1 试验项目试验项目8.1.1 体重8.1.2 常压耐缺氧实验8.1.3 亚硝酸钠中毒存活实验8.1.4 急性脑缺血性缺氧实验8.2 试验原则试验原则所列指标均为必做项目。8.3 结果判定结果判定常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验、急性脑缺血性缺氧实验三项实验中任二项实验结果阳性，可判定该受试样品具有耐缺氧的作用。9 有助于控制体内脂肪9.1 试验项目试验项目9.1.1 动物实验9.1.1.1 体重、体重增重9.1.1.2 摄食量、摄入总热量9.1.1.3 体内脂肪含量（睾丸及肾周围脂肪垫）9.1.1.4 脂/体比9.1.2 人体试食试验9.1.2.1 体重9.1.2.2 腰围、臀围9.1.2.3 体内脂肪含量9.2 试验原则试验原则9.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。9.2.2 动物实验中大鼠肥胖模型法和预防大鼠肥胖模型法任选其一。9.2.3 控制体内多余脂肪，不单纯以减轻体重为目标。9.2.4 引起腹泻或抑制食欲的受试样品不能作为有助于控制体内脂肪食品。9.2.5 每日营养素摄入量应基本保证机体正常生命活动的需要。9.2.6 对机体健康无明显损害。9.2.7 实验前应对同批受试样品进行违禁药物的检测。- 6 -9.2.8 以各种营养素为主要成分替代主食的有助于控制体内脂肪食品可以不进行动物实验，仅进行人体试食试验。9.2.9 不替代主食的有助于控制体内脂肪试验，应对试食前后的受试者膳食和运动状况进行观察。9.2.10 替代主食的有助于控制体内脂肪试验，除开展不替代主食的设计指标外，还应设立身体活动、情绪、工作能力等测量表格，排除服用受试样品后无相应的负面影响产生。结合替代主食的受试样品配方，对每日膳食进行营养学评估。9.2.11 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。9.3 结果判定结果判定9.3.1 动物实验：实验组的体重或体重增重低于模型对照组，体内脂肪含量或脂/体比低于模型对照组，差异有显著性，摄食量不显著低于模型对照组，可判定该受试样品有助于控制体内脂肪动物实验结果阳性。9.3.2 人体试食试验：不替代主食的有助于控制体内脂肪受试样品：试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，体内脂肪含量减少，皮下脂肪四个点中任两个点减少，腰围与臀围之一减少，且差异有显著性，运动耐力不下降，对机体健康无明显损害，并排除膳食及运动对有助于控制体内脂肪作用的影响，可判定该受试样品具有有助于控制体内脂肪的作用。替代主食的有助于控制体内脂肪受试样品：试食组试验前后自身比较，其体内脂肪含量减少，皮下脂肪四个点中至少有两个点减少，腰围与臀围之一减少，且差异有显著性（P10%或降至正常；TG 降低15%或降至正常；HDL-C 上升0.104mmol/L。血脂总有效：TC、TG、HDL-C三项指标均达到有效标准者。无效：未达到有效标准者。19.3.2.1 有助于维持血脂（胆固醇/甘油三酯）健康水平结果判定试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇降低，差异均有显著性，同时血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组血脂总有效率显著高于对照组，可判定该受试样品有助于维持血脂（胆固醇/甘油三酯）健康水平人体试食试验结果阳性。19.3.2.2 有助于维持血胆固醇健康水平功能结果判定试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇降低，差异有显著性，同时血清甘油三酯不显著高于对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组血清总胆固醇有效率显著高于对照组，可判定该受试样品有助于维持血胆固醇健康水平功能人体试食试验结果阳性。19.3.2.3 有助于维持血甘油三酯健康水平功能结果判定- 14 -试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，受试者血清甘油三酯降低，差异有显著性，同时血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇不显著高于对照组，血清高密度脂蛋白胆固醇不显著低于对照组，试验组血清甘油三酯有效率显著高于对照组，可判定该受试样品有助于维持血甘油三酯健康水平功能人体试食试验结果阳性。20 有助于维持血糖健康水平20.1 试验项目试验项目20.1.1 动物实验分为方案一（胰岛损伤高血糖模型）和方案二（胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型）两种20.1.1.1 方案一（胰岛损伤高血糖模型）20.1.1.1.1 体重20.1.1.1.2 空腹血糖20.1.1.1.3 糖耐量20.1.1.2 方案二（胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型）20.1.1.2.1 体重20.1.1.2.2 空腹血糖20.1.1.2.3 糖耐量20.1.1.2.4 胰岛素20.1.1.2.5 总胆固醇20.1.1.2.6 甘油三酯20.1.2 人体试食试验20.1.2.1 空腹血糖20.1.2.2 餐后 2 小时血糖20.1.2.3 糖化血红蛋白（HbA1c）或糖化血清蛋白20.1.2.4 总胆固醇20.1.2.5 甘油三酯 20.2 试验原则试验原则20.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。20.2.2 根据受试样品作用原理不同，方案一和方案二动物模型任选其一进行动物实验。20.2.3 除对高血糖模型动物进行所列指标的检测外，应进行受试样品对正常动物空腹血糖影响的观察。20.2.4 人体试食试验可在临床治疗的基础上进行。20.2.5 应对临床症状和体征进行观察。20.2.6 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。20.3 结果判定结果判定20.3.1 动物实验：- 15 - 方案一：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品有助于维持血糖健康水平动物实验结果阳性。方案二：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，血脂（总胆固醇、甘油三酯）无明显升高，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品有助于维持血糖健康水平动物实验结果阳性。20.3.2 人体试食试验：空腹血糖、餐后 2 小时血糖、糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白） 、血脂四项指标均无显著升高，且空腹血糖、餐后 2 小时血糖两项指标中一项指标阳性，对机体健康无不利影响，可判定该受试样品具有有助于维持血糖健康水平的作用。21 有助于维持血压健康水平21.1 试验项目试验项目21.1.1 动物实验21.1.1.1 体重21.1.1.2 血压21.1.1.3 心率21.1.2 人体试食试验21.1.2.1 临床症状与体征21.1.2.2 血压21.1.2.3 心率 21.2 试验原则试验原则 21.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。21.2.2 动物实验应选择高血压模型动物和正常动物进行所列指标的观察。21.2.3 人体试食试验可在临床治疗的基础上进行。21.2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。21.3 结果判定结果判定 21.3.1 动物实验：实验组动物血压明显低于对照组，且对实验组动物心率和正常动物血压及心率无影响，可判定该受试样品有助于维持血压健康水平动物实验结果阳性。21.3.2 人体试食试验：舒张压或收缩压二项指标中任一指标结果阳性，可判定该受试样品具有有助于维持血压健康水平的作用。22 对化学性肝损伤有辅助保护作用22.1 试验项目试验项目动物实验分为方案一（四氯化碳肝损伤模型）和方案二（酒精肝损伤模型）两种。22.1.1 方案一（四氯化碳肝损伤模型）22.1.1.1 体重22.1.1.2 谷丙转氨酶（ALT）- 16 -22.1.1.3 谷草转氨酶（AST）22.1.1.4 肝组织病理学检查22.1.2 方案二（酒精肝损伤模型）22.1.2.1 体重22.1.2.2 丙二醛（MDA）22.1.2.3 还原型谷胱甘肽（GSH）22.1.2.4 甘油三酯（TG）22.1.2.5 肝组织病理学检查22.2 试验原则试验原则22.2.1 所列指标均为必做项目。22.2.2 根据受试样品作用原理的不同，方案一和方案二任选其一进行动物实验。22.3 结果判定结果判定方案一（四氯化碳肝损伤模型）：病理结果阳性，谷丙转氨酶和谷草转氨酶二指标中任一项指标阳性，可判定该受试样品具有对化学性肝损伤有辅助保护作用功能作用。方案二（酒精肝损伤模型）：肝脏 MDA、GSH、TG 三项指标结果阳性，可判定该受试样品对乙醇引起的肝损伤有辅助保护功能，肝脏 MDA、GSH、TG 三指标中任二项指标阳性，且肝脏病理结果阳性，可判定该受试样品具有对乙醇引起的肝损伤有辅助保护作用功能的作用。23 对电离辐射危害有辅助保护作用23.1 实验项目实验项目23.1.1 体重23.1.2 外周血白细胞计数23.1.3 骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数23.1.4 小鼠骨髓细胞微核实验23.1.5 血组织中超氧化物歧化酶活性实验23.1.6 血清溶血素含量实验23.2 实验原则实验原则外周血白细胞计数、骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数、小鼠骨髓细胞微核实验、血 组织中超氧化物歧化酶活性实验、血清溶血素含量实验中任选择三项进行实验。23.3 结果判定结果判定在外周血白细胞计数、骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数、小鼠骨髓细胞微核、血 组织中超氧化物歧化酶活性、血清溶血素含量五项实验中任何二项实验结果阳性，可判定该受试样品具有对电离辐射危害有辅助保护作用功能的作用。- 17 -24 有助于排铅24.1 试验项目试验项目24.1.1 动物实验24.1.1.1 体重 24.1.1.2 血铅24.1.1.3 骨铅24.1.1.4 肝组织铅24.1.2 人体试食试验24.1.2.1 血铅24.1.2.2 尿铅24.1.2.3 尿钙24.1.2.4 尿锌24.2 试验原则试验原则24.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。24.2.2 应对临床症状、体征进行观察。24.2.3 对尿铅进行多次测定，以了解体内铅的排出情况。24.2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。24.3 结果判定结果判定24.3.1 动物实验：实验组与模型对照组比较，骨铅含量显著降低，同时血铅或肝铅含量显著降低，可判定该受试样品动物实验结果为阳性。24.3.2 人体试食试验：试食组与对照组组间比较，至少两个观察时点尿铅排出量增加且显著高于试验前，或总尿铅排出量明显增加。同时，对总尿钙、总尿锌的排出无明显影响，或总尿钙、总尿锌排出增加的幅度小于总尿铅排出增加的幅度，可判定该受试样品具有有助于排铅的作用。- 18 -第二部分 功能学检验方法一、有助于增强免疫力检验方法1. 实验动物实验动物推荐用近交系小鼠，1822g，单一性别，每组 1015 只。2. 剂量分组及受试样品给予时间剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的 10 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间 30 天，必要时可延长至 45 天。免疫模型动物实验时间可适当延长。3. 实验方法实验方法3.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验可任选下列方法之一3.1.1 MTT 法3.1.1.1 原理当 T 淋巴细胞受 ConA 刺激后发生母细胞发生增殖反应，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将 MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶，其光密度值能反映细胞的增殖情况。3.1.1.2 仪器和材料RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME） 、青霉素、链霉素、刀豆蛋白 A（ConA） 、盐酸、异丙醇、MTT、Hanks 液、PBS 缓冲液（pH7.2-7.4）纱布或 200 目筛网、24 孔培养板，96 孔培养板（平底） ，手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721 分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。3.1.1.3 实验步骤3.1.1.3.1 试剂配制完全培养液 RPMI1640 培养液过滤除菌，用前加入 10%小牛血清，1%谷氨酰胺（200mmol/L） ，青霉素（100U/mL） ，链霉素（100g/L）及 5105mol/L 的 2-巯基乙醇，用无菌的 1mol/L 的 HCl 或 1mol/L 的NaOH 调 pH 至 7.0-7.2，即完全培养液。ConA 液 用双蒸水配制成 100g/mL 的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20）保存。无菌 Hanks 液 用前以 3.5%的无菌 NaHCO3调 pH 至 7.2-7.4。MTT 液 将 5mg MTT 溶于 1mL pH7.2 的 PBS 中，现配现用。酸性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入 4mL 1mol/L 的 HCl，临用前配制。3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks 液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经 200 目- 19 -筛网过滤，或用 4 层纱布将脾磨碎，用 Hanks 液洗 2 次，每次离心 10min（1000r/min） 。然后将细胞悬浮于1mL 的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95%以上） ，调整细胞浓度为 3106个/mL。3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应将每一份脾细胞悬液分两孔加入 24 孔培养板中，每孔 1mL，一孔加 75L ConA 液（相当于 7.5g/mL） ，另一孔作为对照，置 5%CO2，37CO2孵箱中培养 72h。培养结束前 4h，每孔轻轻吸去上清液 0.7mL，加入 0.7mL 不含小牛血清的 RPMI1640 培养液，同时加入 MTT（5mg/mL）50L /孔，继续培养 4h。培养结束后，每孔加入 1mL 酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到 96 孔培养板中，每个孔作 3个平行孔，用酶标仪，以 570nm 波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入 2mL 比色杯中，721 分光光度计上在波长 570nm 测定 OD 值。3.1.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值F0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加 ConA 孔的光密度值减去不加 ConA 孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。3.1.1.5 注意事项本实验中 ConA 的浓度很重要，过低不能刺激足够的细胞增殖，过高会抑制细胞增殖，不同批号的ConA 在实验前要进行预试，以找到最佳浓度。3.1.2 同位素掺入法3.1.2.1 原理T 淋巴细胞在有丝分裂原 PHA、ConA 等的刺激下，产生增殖反应，DNA 和 RNA 合成明显增加，如在培养液中加入3H胸腺嘧啶核苷（3H-TdR） ，则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。3.1.2.2 仪器和材料RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME） 、青霉素、链霉素、刀豆蛋白 A（ConA） 、Hanks 液、PBS 缓冲液（pH7.2-7.4） 、3H-TdR、闪烁液2,5-二苯基恶唑（PPO）0.5g、1,4-双-（5-苯基恶唑基）-苯（POPOP）0.25g、二甲苯 500mL 混匀200 目筛网，96 孔培养板（平底） ，手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49 型玻璃纤维滤纸。3.1.2.3 实验步骤3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks 液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经 200目筛网过滤，用 Hanks 液洗 3 次，每次离心 10min（1000r/min） 。然后将细胞悬浮于 2mL 的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95%以上） ，最后用 RPMI1640 完全培养液将细胞数调成 5106个/mL。3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应- 20 -将脾细胞悬液加入到 96 孔培养板中，200L/孔，每一份脾细胞悬液分装 6 个孔，3 孔加ConA（5g/mL） ，另 3 个孔不加 ConA 作为对照。置 5% CO2，37培养 72h，培养结束前 6h，每孔加入3H-TdR 20L，使其终浓度为（3.7-18.5）104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入 7mL 闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm） 。3.1.2.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值F0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示SI=cpmcpm对照孔实验孔受试样品组的 SI 值显著高于对照组的 SI 值，即可判定该项实验结果阳性。3.2 迟发型变态反应（迟发型变态反应（DTH）可任选下列方法之一3.2.1 二硝基氟苯诱导小鼠 DTH（耳肿胀法）3.2.1.1 原理二硝基氟苯（DNFB）稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。47 天后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部肿胀，一般在抗原攻击后 2448h 达高峰，其肿胀程度可以反应映迟发型变态反应程度。3.2.1.2 材料 DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。3.2.1.3 实验步骤3.2.1.3.1 试剂配制DNFB 溶液 DNFB 溶液应新鲜配制，称取 DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的 5mL 丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：1） ，倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用 250L 注射器通过瓶盖取用。3.2.1.3.2 致敏 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛或剃毛，范围约 3cm3cm，用 DNFB 溶液 50L 均匀涂抹致敏。3.2.1.3.3 DTH 的产生与测定 5 天后，用 DNFB 溶液 10L 均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径 8mm 的耳片，称重。3.2.1.4 数据处理与结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值F0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。- 21 -用左右耳重量之差表示 DTH 的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。3.2.1.5 注意事项 操作时应避免 DNFB 与皮肤接触。3.2.2 绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠 DTH（足跖增厚法）3.2.2.1 原理 SRBC 可刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4 天后，当再以 SRBC 攻击时，攻击部位出现肿胀，其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。3.2.2.2 材料 游标卡尺（精密度 0.02mm） 、SRBC、微量注射器（50L） 。3.2.2.3 实验步骤3.2.2.3.1 致敏 小鼠用 2%（v/v）SRBC 腹腔或静脉免疫，每只鼠注射 0.2mL（约 1108个 SRBC） 。3.2.2.3.2 DTH 的产生与测定 免疫后 4 天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射 20%（v/v）SRBC，每只鼠 20L（约 1108个 SRBC） ，注射后于 24h 测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。3.2.2.4 数据处理和结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值F0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以攻击前后足跖厚度的差值来表示 DTH 的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。3.2.2.5 注意事项 测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。 攻击时所用的 SRBC 要新鲜（4保存期不超过 1 周） 。3.3 抗体生成细胞检测（抗体生成细胞检测（Jerne 改良玻片法）改良玻片法）3.3.1 原理经过绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的 SRBC 混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的 SRBC 溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数可反映抗体生成细胞数。3.3.2 仪器和材料 二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200 目筛网、SRBC、补体（豚鼠血清） 、Hanks 液、RPMI1640 培养液、SA 缓冲液、琼脂糖。3.3.3 实验步骤3.3.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4冰箱保存备用，可保存 2 周。3.3.3.2 制备补体 采集豚鼠血，分离出血清（至少 5 只豚鼠的混合血清） ，将 1mL 压积 SRBC 加入到 5mL- 22 -豚鼠血清中，4冰箱放置 30min，经常振荡，离心取上清，分装，70保存。用时以 SA 缓冲液按1：815 稀释。3.3.3.3 玻片涂膜 在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0.5g 琼脂糖加双蒸水至 100mL，加热溶解） ，干后可长期保存备用。3.3.3.4 免疫动物 取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤 3 次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射 SRBC 51072108个。也可将压积 SRBC 用生理盐水配成 2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射 0.2mL。3.3.3.5 脾细胞悬液制备 将 SRBC 免疫 45 天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有 Hanks 液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经 200 目筛网过滤，或用 4 层纱布将脾磨碎，离心（1000r/min）10min，用 Hanks 液洗2 遍，最后将细胞悬浮在 5mL RPMI1640 培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为 5x106个/mL。也可将细胞悬浮在 8mL Hanks 液。3.3.3.6 空斑的测定 将表层培养基（1g 琼脂糖加双蒸水至 100mL）加热溶解后，放 4550水浴保温，与等量pH7.27.4、2 倍浓度的 Hanks 液混合，分装小试管，每管 0.5mL，再向管内加 50L 10% SRBC（v/v，用SA 缓冲液配制） ，20L 脾细胞悬液（5106个/mL）或 25L 脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育 11.5h，然后用 SA 缓冲液稀释的补体（1：8）加入到玻片架凹槽内，继续温育 11.5h 后，计数溶血空斑数。3.3.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值F0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用空斑数/105脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。3.4 血清溶血素的测定血清溶血素的测定 可任选下列方法之一。3.4.1 血凝法3.4.1.1 原理 用 SRBC 免疫动物后，产生抗 SRBC 抗体（溶血素） ，利用其凝集 SRBC 的程度来检测溶血素的水平。3.4.1.2 仪器和材料 SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机3.4.1.3 实验步骤3.4.1.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入 4冰箱保存备用，可保存 2 周。3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤 3 次，每次离心（2000r/min）10min。将压积- 23 -SRBC 用生理盐水配成 2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射 0.2mL 进行免疫。45 天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约 1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min 离心 10min，收集血清。3.4.1.3.3 凝集反应 用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100L，再加入 100L 0.5%（v/v）的 SRBC 悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于 37温箱孵育 3h，观察血球凝集程度。3.4.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F 值F0.05，P0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。血清凝集程度一般分为 5 级（0IV）记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。抗体水平（S1+2S2+3S3nSn）式中 1、2、3n 代表对倍稀释的指数，S 代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。0 级 红细胞全部