食品微生物检验技术.doc

国家示范性高等职业院校建设成果食品微生物检验技术食品微生物检验技术课程组日照职业技术学院食品工程学院二零一零年八月无菌取样样品均质样品接种恒温培养结果观察样液稀释微生物检验基本流程图微生物实验室平面结构设计图前 言本教材是“教育部、财政部国家示范性高等职业院校建设项目-食品加工技术专业及专业群建设”的成果食品是人类赖以生存和发展的物质基础，食品安全问题是关系到人身健康和经济社会发展的重大问题。食品不同于其它工业产品的显著特点之一，就是在于它们很容易被微生物污染，而引起食物中毒或食源性传染疾病。因而，食品卫生质量，是食品企业质量管理工作的核心和重点，而食品质量监管体系中食品微生物检验技术是重要内容，为了做到教、学、做一体化，实现学训同步，我们把过去的微生物检验技术的内容分为四个学习情境，即微生物观察技术学习情境，微生物培养技术学习情境，微生物检验实验室设计与管理和食品卫生微生物检验技术。微生物检验技术作为食品卫生检验与管理的重要组成部分，通过该课程的学习，使学生成为既能掌握食品卫生微生物学检验技术又能按照食品安全质量管理体系进行生产管理的高技能人才，基于此，我们组织了具有丰富专业理论和实践经验的8位教师和企业生产管理、检验技术人员组成课程组编写了食品微生物检验技术一书。食品微生物检验技术是高职高专食品类专业的一门重要职业岗位技术课，主要培养学生的食品卫生微生物学检验与实验室管理能力，因此，本书在编写过程中始终贯穿了如下若干指导思想：1. 本教材编写过程中注意与生物化学、微生物学等学科前后知识的衔接，避免重复，突出了食品卫生检验与管理所涉及到相关内容的前后知识的有机结合与互相支撑，内容简洁不重复。强化了食品卫生微生物学检验技术，实验室建设与管理以及食品检验标准选择能力等方面知识的传授，注重实际操作技能的培养、内容上要满足学生职业能力拓展的需要。2. 根据食品卫生检验技术岗位的需要，将检验标准、检验技术和管理技术有机结合，避免了单纯讲检验技术而不讲标准与管理的弊端。内容上实现了理论与技能训练相结合，技术与检验标准相结合，检验与质量管理相结合，突出高职教育特色。3. 在编写形式上，每一学习子情景开始都有学习目标，实训内容结束后有实验报告的编写与少而精的学导式思考题，以方便学生巩固知识、举一反三、活学活用。食品微生物检验技术是一门应用性很强的专业技术课，在编写内容上充分考虑这一特点，做到学训同步，尤其是在食品卫生微生物检验部分针对国家标准设计了综合实训以及企业实训项目，以培养学生对理论知识运用的综合能力。 本教材可以作为高职高专食品加工、食品营养与检测以及食品生物技术等专业的教材和食品卫生检验人员技能鉴定培训教材，也可以作为相关专业的科研人员及食品企业卫生检验、生产管理技术人员的参考资料。由于编者水平和时间有限，缺点和错误在所难免，请广大读者和同行专家提出宝贵意见。编者2010.8 于日照职业技术学院泽厚园 目录学习情境一 微生物的观察技术- 1 -学习情境描述- 1 -子学习情境一 革兰氏染色法- 1 -子学习情境二 细菌的芽孢染色法- 4 -子学习情境三 酵母菌子囊孢子的观察- 7 -子学习情境四 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别- 9 -子学习情境五 四大类微生物菌落观察技术- 11 -学习情境二 微生物培养技术- 15 -学习情境描述- 15 -子学习情境一 淀粉水解- 15 -子学习情境二 微生物显微计数技术- 17 -子学习情境三 微生物生长曲线的测定- 21 -子学习情境四 IMVic与硫化氢试验- 23 -子学习情境五 糖发酵试验- 29 -子学习情境六 过氧化物酶测定- 31 -子学习情境七 微生物分离技术- 32 -学习情境三 食品微生物检验实验室设计与管理- 35 -学习情境描述- 35 -子学习情境一 编写一份实验报告- 36 -一、原始记录- 37 -（一）原始记录- 37 -二、试验设计- 38 -三、最近似值（MPN）计数法- 39 -子学习情境二 设计一个工厂微生物检验室- 41 -一、实验室的管理- 42 -二、实验室的认证认可- 42 -（一）认可与认证- 42 -（二）实验室认可原则- 43 -（三）实验室认可体系- 43 -(四)实验室认可的条件- 44 -（五）认可程序- 44 -学习情境四 食品卫生微生物检验技术- 46 -子学习情境一 菌落总数的检验- 46 -子学习情境二 大肠菌群、粪大肠菌群- 50 -和大肠杆菌的检验与分析- 50 -子学习情境三 沙门氏菌的检验与分析- 56 -子学习情境四 金黄色葡萄球菌的检验与分析- 64 -子学习情境五 乳与乳制品卫生检验技术- 67 -子学习情境六 自来水微生物检验技术- 69 -子学习情境七 水产食品卫生微生物检验- 70 -子学习情境八 粮食中霉菌的检验技术- 72 -子学习情境九 肉与肉制品卫生检验- 73 -学习情境一 微生物的观察技术学习情境描述了解微生物的概念与分类；掌握原核微生物、真核微生物、病毒的形态结构；掌握微生物观察方法并熟练完成实训项目。子学习情境一 革兰氏染色法【学习目标】1.学习并初步掌握革兰氏染色法。2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。【知识准备】一、基本原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。二、细菌细胞的细胞壁(cell wall)细胞壁是菌体细胞外壁，为细菌表面较复杂结构，是一层较厚(580nm)、质量均匀的网状结构，可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏。细胞壁坚韧而有弹性，使细菌具有一定的形态和保护菌体的作用。其主要作用表现在以下几个方面：固定细胞外形；协助鞭毛运动；保护细胞免受外力的损伤；为正常细胞分裂所必需；阻拦大分子物质进入细胞(如革兰氏阴性细菌细胞壁可阻拦分子量超过800的抗生素透入)；与细菌的抗原性、致病性(如内毒素)和对噬菌体的敏感性密切相关。在电子显微镜下观察细胞壁很明显，壁的外表面较内表面粗糙。细胞壁的厚度可以在电子显微镜下测定，例如，金黄色葡萄球菌为1550nm；大肠杆菌和雏白痢沙门氏菌(Salpullorum)为1015nm。图15细菌细胞的结构图1细胞质膜；2细胞壁；3荚膜；4异染颗粒；5纤毛；6鞭毛；7色素体；8脂质颗粒；9中体；10核糖体；11拟核；12横隔壁细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖、蛋白质和脂肪，有的还含有磷壁酸、脂多糖等物质。不同种类的细菌，其细胞壁成分和结构是不同的，故能用染色法进行鉴别。革兰氏（Gram）染色法，就是微生物学中常用的鉴别细菌的染色法。染色时，先用碱性染料结晶紫着色，然后加碘液助染，再用酒精(乙醇)脱色，最后用复红等生物染料进行复染。经酒精处理不脱色，而被染成紫色者，称革兰氏阳性反应(G+)；经酒精处理迅速脱色仅呈复染颜色(红色)者，称革兰氏阴性反应(G-)。革兰氏阴性细胞壁较薄，不含磷壁酸，肽聚糖含量较低，由于乙醇具有脂溶性，故使G-菌细胞壁增加通透性，从而使结晶紫一碘复合物析出而脱色。革兰氏阳性菌细胞壁较厚，含磷壁酸和大量肽聚糖，脂类含量低，在乙醇处理时，由于脱水作用而使肽聚糖结构层收缩，结构直径变小，通透性降低，结晶紫碘复合物被束缚在细胞壁内，故不脱色，而为G+。革兰氏染色有着十分重要的理论与实践意义。通过这一染色，几乎可把所有的细菌分成革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌两个大类，因此，它是分类鉴定菌种时的重要指标。又由于这两大类细菌在细胞结构、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都呈现出明显的差异，因此，任何细菌只要通过简单的革兰氏染色，就可提供不少其他重要的生物学特性方面的信息。【工作任务】一、器材1菌种 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌培养1220h营养琼脂斜面培养物。2染色剂革兰氏染色液。3仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，擦镜纸，生理盐水，双层瓶等。二、操作步骤1制片取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热(以玻片不烫手为宜)。2初染滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色12min，水洗。3媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1nun，水洗。4脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约2030s。5复染用番红液复染约2min，水洗。6镜检干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。7混合涂片染色按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。图1-1革兰氏染色程序1加草酸铵结晶染1n'fim2水洗；3加碘液媒染lmin；4水洗，5己醇脱色约2030s，6水洗；7番红复染约2mira8水洗，9用吸水纸吸干三、实验报告1结果列表简述3株细菌的染色观察结果(说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。2思考题(1)你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么?(2)现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。(3)你的染色结果是否正确?如果不正确，请说明原因。(4)进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?(5)革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?(6)你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果?在什么情况下可以采用?子学习情境二 细菌的芽孢染色法【学习目标】1学习并掌握芽孢染色法。2初步了解芽孢杆菌的形态特征。【知识准备】一、基本原理芽孢又叫内生孢子(endospore)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被永洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。二、芽孢(germ)某些杆菌生长发育到一定阶段，当处于特定环境条件时，由胞浆胞质浓缩脱水后，在菌体内形成的一个折光性强、通透性低的坚实小体，叫细菌芽孢。在不同的细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形和圆柱形。带有芽孢的菌体称芽孢体，未形成芽孢的菌体称繁殖体。在细菌细胞内形成芽孢的性质是一些细菌的特征，在杆菌中只有两属是产生芽孢的：一种为芽孢杆菌属(Bacillus)；另一种为梭状芽孢杆菌属(clostridium)。在球菌中只发现一种尿素八叠球菌(Sarcina ureae)是产生芽孢的。芽孢一般只在动物体外才能形成，并受环境影响。当水分缺乏或营养物质不足，特别是碳源、氮源或磷酸盐不足时，容易形成芽孢。菌种不同其形成条件亦不同：如炭疽杆菌需要温度适宜(3032)；厌氧芽孢杆菌需严格厌氧和营养丰富环境中才能形成芽孢。目前一般认为芽孢的形成是通过以下几个阶段(见图12)。图1-2细菌形成芽孢的过程脱水浓缩。菌体内细胞质在一定的生活阶段或由于环境条件的变化，大量失去水分，细胞内细胞质变得浓缩而集中在菌体的局部。芽孢形成过程中的吡啶-2，6-二甲酸含量高达芽孢干重的515，它以钙盐的形式存在。芽孢膜形成。菌体内浓缩的细胞质周围形成两层膜，即内膜和外膜。外膜结构比较紧密而坚硬，含有拟脂质，它能阻止菌体外面水溶性物质及热力渗透进去。内膜在芽孢发芽时即形成繁殖体的细胞壁。芽孢游离。形成了芽孢的菌体不再繁殖，且处于休眠状态。以后菌体破裂，芽孢即游离出来。由上可知，芽孢是细菌处于代谢相对静止的休眠状态，以维持细菌生存的持久体。当环境条件适宜时，成熟的芽孢可被许多正常代谢物如丙氨酸、腺苷、葡萄糖、乳酸等激活而发芽，先是芽孢酶活化，皮质层及外壳迅速解聚，水分进入，在合适的营养和温度条件下，芽孢的核心向外生长成繁殖体，开始发育和分裂繁殖。一个芽孢只能形成一个菌体，故芽孢不是细菌的繁殖器官。芽孢对外界环境的抵抗力比繁殖体强得多，特别是耐高温和渗透压作用，一般化学药品也不容易渗透进去。主要表现在以下几个方面。芽孢壁有多层结构，其通透性很低，特别是芽孢壳，无通透性，有保护作用，能阻止化学品渗入，所以消毒剂不能用于杀灭芽孢。芽孢含水量少(约40)，其内的酶类和蛋白质不易遇热凝固变性，故短时高温仍不能杀灭芽孢(如破伤风芽孢可耐受13h煮沸)。芽孢形成时能合成一些特殊的酶，这些酶较之繁殖体中的酶具有更强的耐热性。如芽孢形成过程中很快合成大量DPA(吡啶二羧酸)，同时也获得耐热性。DPA占芽孢干重的515，是芽孢所特有的成分，在细菌繁殖体和其他生物细胞中都没有。芽孢内酶活性与新陈代谢极低，故干燥和营养缺乏时可长时间存活。芽孢在土壤中可存活几年至几十年，故土壤中经常有破伤风梭菌芽孢和炭疽杆菌芽孢存在。芽孢在自然界分布广泛，芽孢的抵抗力强，因此，要严防芽孢污染伤口、用具、敷料、手术器械等。用一般的化学消毒法不能彻底杀死芽孢。杀灭芽孢最有效的方法是高压蒸汽灭菌法。当进行消毒灭菌时往往以芽孢是否被杀死作为判断灭菌效果的指标。由于芽孢有以上几个特性，所以芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料。【工作任务】一、器材1菌种 蜡样芽孢杆菌约2d营养琼脂斜面培养物，球形芽孢杆菌（B.sphaericus）12d营养琼脂斜面培养物。2染色剂 5孔雀绿水溶液，0.5番红水溶液。3仪器或其他用具 小试管，滴管，烧杯，试管架，载玻片，木夹子，显微镜等。二、操作步骤(一)改良的SchaefferFulton氏染色法1制备菌悬液加l2滴水于小试管中，用接种环挑取23环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢囊为宜；取菌不宜太少。2染色加孔雀绿染液23滴于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色1520min。3涂片固定用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。4脱色水洗，直至流出的水无绿色为止。5复染用番红染液染色23mln，倾去染液并用滤纸吸干残液。6镜检干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。(二)Schaeffer-Fulton氏染色法1制片按常规涂片、干燥、固定。2染色加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时，维持5mm。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。3水洗待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。4复染用番红染液复染2min。5水洗用缓流水洗后，吸干。6镜检干后油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。三、实验报告1结果绘图表示两种芽孢杆菌的形态特征(注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征)。2思考题(1)说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?(2)用SchaefferFulton氏染色法加热染色时，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立即补加染液?为什么?(3)若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？子学习情境三 酵母菌子囊孢子的观察【学习目标】学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。【知识准备】一、基本原理子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏(McClary)培养基(葡萄糖一醋酸钠培养基)有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。二、酵母真核微生物是一类具有真正细胞核，具有核膜与核仁分化的较高等的微生物，其细胞质中具有线粒体、内质网等细胞器。真核微生物包括真菌、单细胞藻类和原生动物。本节主要介绍真菌。真菌门下面分为5个亚门：鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。真菌是一个分布广阔的庞大类群，约有十几万种。真菌细胞中没有光合色素，不能进行光合作用；细胞形态少数是单细胞，多数具有分支的丝状体；具有完整的、典型的细胞核；能进行有丝分裂，繁殖方式主要靠无性孢子和有性孢子。一般把真菌分为三类：单细胞的酵母菌、单细胞或多细胞的霉菌和产生子实体的蕈菌。酵母菌是指以出芽繁殖为主的单细胞真菌的俗称，在分类上属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲。主要分布在含糖质较高的偏酸环境中，如果品、蔬菜、花蜜、植物叶子的表面和果园的土壤中，固有“糖菌”之称。此外，在动物粪便、油田和炼油厂附近的土壤中也能分离到利用烃类的酵母菌。酵母菌大多为腐生型，少数为寄生型。酵母菌的形态与结构（1）酵母菌的形态和大小大多数酵母菌为单细胞，细胞的形态多种多样,一般有卵圆形、圆形、圆柱形、柠檬形或假丝状如图1-3。假丝状是指有些酵母菌的细胞进行一连串的芽殖后，长大的子细胞与母细胞不分离，彼此连成藕节状或竹节状的细胞串，形似霉菌菌丝，为了区别于霉菌的菌丝，称之为假菌丝。酵母菌细胞的大小依其种类差别很大，一般长约530m，宽15m，比细菌大几倍至几十倍。酵母菌的形状与大小，可因培养条件及菌龄不同而改变，如一般的成熟的细胞大于幼龄细胞，液体培养的细胞大于固体培养的细胞。图1-3 酵母菌的显微形态（2）酵母菌的结构图1-4酵母菌的基本结构图1.线粒体2.芽体内的液泡3.芽体4.细胞核5.核孔6.液泡7.液泡膜8.出芽痕9.细胞膜10.细胞壁11.液泡颗粒12.贮藏颗粒酵母菌是真核微生物，具有典型的真核细胞结构。酵母菌的细胞与细菌的细胞一样有细胞壁、细胞膜和细胞质等基本结构以及核糖体等细胞器，此外酵母菌细胞还具有一些真核细胞特有的结构和细胞器，如细胞核有核仁和核膜，染色体由DNA与蛋白质结合形成，能进行有丝分裂，细胞质中有线粒体、中心体、内质网和高尔基体等细胞器以及多糖、脂类等储藏物质。图1-4是酵母菌的细胞结构图。1）细胞壁 幼龄酵母菌的细胞壁与细胞膜均较薄，老龄酵母菌的细胞壁与细胞膜较厚。酵母菌的细胞壁厚约2570nm，约占细胞干重的25%。其化学组成主要内层为葡聚糖、外层为甘露聚糖、中间层为蛋白质。此外还含有不等量的类脂质和几丁质。细胞壁决定着细胞的形状，具抗原性，起到保护菌体的作用。2）细胞膜 酵母菌细胞膜厚约7.5nm，结构成分与细菌基本相同，主要有蛋白质和类脂以及少量糖类组成。细胞膜具有半渗透性，主要是控制细胞内外物质的交换，参与细胞壁和部分酶的合成。3）细胞质 细胞质也称原生质，它是一种粘稠的胶体，主要成分是蛋白质。幼龄细胞的细胞质较稠密而均匀，老龄细胞的细胞质出现较大的液泡和各种贮藏物。细胞质含有核糖核酸（RNA）、肝糖、脂肪滴等物质，还有核糖体，内质网膜等重要的细胞器，所以细胞质是细胞新陈代谢的场所。贮藏物质 以聚合物颗粒存在，有些酵母含有大量的脂肪、蛋白质和多糖。线粒体 线粒体是酵母细胞的重要细胞器，具有呼吸酶系，是能量代谢的主要场所。线粒体呈球状或杆状，由双层膜组成，内膜折迭而成嵴。它含由大量的酶系，在制备、积累和分配细胞能量上起着极其重要作用，被称为细胞的动力站。液泡 在酵母细胞质中，常含有一个或几个液泡。液泡内含有机酸及其盐类的水溶液，可能起着贮藏营养物和水解酶的作用。液泡往往在细胞的中老熟期出现，其多少和大小作为衡量细胞成熟的标志。4）细胞核 酵母菌为真核生物，细胞质中具有明显完整的细胞核。幼龄细胞核呈圆形，位于细胞中央，成年后由于液泡的出现和扩大而被挤到一边，呈肾形。核外有包裹着核的核膜，核内有核仁和染色体。核膜是将细胞质与核质分开的双层膜，膜上有许多小孔，称为核孔。核孔是核质与胞质之间交换物质的选择性通道。核仁是比较稠密的圆球形构造，主要成分是RNA和蛋白质、核仁与RNA和蛋白质的合成有着密切的关系。【工作任务】一、器材1菌种酿酒酵母。2培养基麦芽汁琼脂斜面，麦氏琼脂斜面。3溶液或试剂5的孔雀绿水溶液，05的番红水溶液，95的乙醇。4仪器或其他用具载玻片，显微镜等二、操作步骤1菌种活化将酿酒酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，2528培养24h左右，然后再转种23次麦芽汁斜面培养基需用新配制、表面湿润的。2产孢培养将经活化的菌种转接到麦氏琼脂斜面上，2528培养约l周。3制片取经产孢培养的酵母斜面培养物，在洁净载玻片上按常规涂片、干燥、固定4染色滴加孔雀绿染液染色lmin。5脱色用95的乙醇脱色30s，水洗。6复染用番红复染30s，水洗，用吸水纸吸干。7镜检干后用油镜观察。子囊孢子呈绿色、菌体和子囊呈粉红色。三、实验报告1结果绘图说明酿酒酵母的营养细胞、子囊和子囊孢的形态特征。2思考题如何区别酵母菌的营养细胞和释放出子囊外的子囊孢子?子学习情境四 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别【学习目标】1观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。2掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。【知识准备】一、基本原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。二、酵母菌菌落特征图1-5 酵母菌菌落在固体培养基上酵母菌的菌落与细菌很相似。但由于酵母菌的个体细胞较大，胞内颗粒明显，胞间含水量比细菌的少，所以菌落较大而厚，外观表现光滑、湿润、有粘性，与培养基结合不紧密。菌落颜色较单调，多数呈乳白色，只有少数呈红色、黑色等。有些菌落因培养时间较长，会逐渐生皱，变得较为干燥，颜色亦较原先为暗。假丝酵母因其边缘常产生丰富的藕节状假菌丝，故细胞易向外围蔓延，使菌落较大，扁平而无光泽，边缘不整齐。菌落的颜色、光泽、质地，表面和边缘等特征都是酵母菌菌种鉴定的依据。1-1是酵母菌与细菌的菌落比较。表1-1酵母菌与细菌的菌落比较比较项目细菌酵母菌主要特征菌落外观很湿或较湿，小而短，或大而平坦很湿，大而突起，光滑有黏性细胞相互关系单个分散或有一定排列单个分散形态特征小而均一，高倍镜无法分辨内部结构大而分化，高倍境下可见内部结构参考特征菌落透明度透明或透明度差不透明结合程度不结合不结合颜色多样多为乳白色少数红色边缘用低倍镜一般看不到细胞，需用高倍镜、油镜用低倍镜有时可见细胞生长速度很快较快气味常有臭味多数有酒香味【工作任务】一、器材1菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培养约2d的麦芽汁(或豆芽汁)斜面培养物。2溶液或试剂005和01吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液。3仪器或其他用具显微镜，载玻片，盖玻片等。二、操作步骤1美蓝浸片的观察(1)在载玻片中央加一滴0.1吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影晌观察。(2)用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。(3)将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。(4)染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。(5)用0.05吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。2水一碘液浸片的观察在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。三、实验报告l结果绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。2思考题(1)吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。(2)在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌? 子学习情境五 四大类微生物菌落观察技术【学习目标】 1.熟悉各大类微生物菌落的形态特征。 2.通过微生物菌落形态观察来识别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌等4大类微生物。【知识准备】一、原理 区分和识别各大类微生物，通常不外乎包括菌落形态(群体形态)和细胞形态(个体形态)两方面观察。细胞的形态构造是群体形态的基础，群体形态则是无数细胞形态的集中反映，故每一大类微生物都有一定的菌落特征，即它们在形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征上都有所差异，一般根据这些差异就能识别大部分菌落。图1-6至图1-8表示一些菌落的直观特点。图1-6细菌菌落形状A、 挺起 B、边缘 C、内部结构图1-7 细菌菌落形成图1-8 菌体斜面上的培养特征【工作任务】一、材料（一）菌种1细菌大肠杆菌(Ecoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。 2放线菌 细黄链霉菌(Strepmicroflavus)、灰色链霉菌(strepgriseus)、天蓝放线菌(Strepcoelicolor)。 3酵母菌 酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)。 4霉菌 米曲霉(Asporyzae)、产黄青霉(Penchrysogenum)。（二）培养基 察氏培养基、马铃薯琼脂培养基、肉汤蛋白胨培养基、麦芽汁培养基。未知菌的培养物：可将以上几种培养基暴露于空气中或用土壤稀释液等涂布后再经培养而成。（四）器皿 培养皿、三角烧瓶(250 mL)、试管、接种针(环)、显微镜。二、流程倒平板接种已知菌接种未知菌培养镜检比较记录三、步骤1倒平板 将不同培养基融化后，倒1012 mL左右于灭菌培养皿内，凝固后使用(用记号笔标记)。2接种已知菌 分别用不同培养基平板，选取一株已知的细菌、放线菌、酵母菌，以划线法制成相应的已知菌平板；选取一株霉菌，用点种法制成已知菌平板。3接种未知菌 分别用不同培养基平板，以空气暴露法或土壤稀释液涂布法制成未知菌平板。4培养 将已知菌平板与未知菌平板培养于适温培养箱中，细菌、酵母菌培养13 d，霉菌、放线菌培养37 d。5观察与比较 将上述4类菌经不同温度等条件培养后，分别进行观察，并以已知菌的一些菌落特征来与各类未知菌的菌落特征进行比较和识别(参考图)。四、结果1已知菌菌落的形态特征记录在表l-2。2将未知菌菌落的辨别结果记录在表1-2。表1-2 各大类微生物菌落形态观察记录表大类比 较菌 落 特 征菌落大小表面边缘色泽厚薄透明度致密度细菌已知菌未知菌思考题1 细菌与酵母菌菌落有何区别？2 如何区别霉菌和放线菌菌落？什么是扩展性菌落？3 如何借助显微镜来观察菌落特征？4 该方法影响孢子发芽率的因素有哪些？哪些实验步骤容易造成结果误差？学习情境二 微生物培养技术学习情境描述根据微生物培养的基本要求，学习掌握微生物培养与灭菌技术；掌握微生物生长与纯种分离技术；掌握微生物生长测定技术及菌种保藏技术；掌握食品加工中微生物的污染与消长；掌握食品检验常见微生物生化反应观察技术。子学习情境一 淀粉水解【学习目标】知识目标1. 掌握淀粉水解的概念及意义。2. 了解淀粉酶结构和测定原理、实验方法。技能目标1. 会解读淀粉水解圈。2. 学会测定淀粉含量。【知识准备】微生物细胞在酶的催化下进行各种各样的生理生化反应，把微生物细胞在一定的条件下培养，通过观察生理现象和检查代谢产物，可以了解微生物的代谢过程和代谢的特点。由于不同的微生物可能具有不同的酶，代谢途径和代谢产物可能也有不同，生理生化反应是微生物分类鉴定的重要指标之一。一、糖(醇)类代谢试验1.糖发酵试验(1)原理多糖®单糖®丙酮酸®酸性产物(或产酸产气)®pH下降®指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现)。不同的细菌可根据分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂（通常为溴甲酚紫，即B.C.P，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气可在发酵培养基中放入倒置小倒管观察。不同的微生物具有发酵不同糖（醇）的酶类，所以发酵途径及发酵产物各不相同。例如：大肠杆菌能使乳糖发酵，产酸产气，而伤寒杆菌则不能；大肠杆菌能使葡萄糖发酵，产酸产气，而伤寒杆菌则只产酸、不产气。(2)试验方法取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各3支，每种糖发酵试管中分别标记大肠杆菌、伤寒杆菌和对照。以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵液的空白对照均不接菌。将装有培养液的小倒管倒置放入试管中，置37恒温箱中培养，分别培养24h、48h和72h观察结果。(3)结果分析紫色（原色）无气泡，既不产酸也不产气用(-)表示；黄色无气泡，产酸不产气，用(+)表示；黄色且有气泡，产酸产气，用(0)表示。糖发酵结果如图2-1。图2-1糖发酵管(4)应用：观察细菌对糖度的分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定。乳糖发酵试验能初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌，肠道致病菌多数不发酵乳糖，肠道非致病菌多数发酵乳糖。2.甲基红试验（M-R试验）(1)原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色反应(见图3-13葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径)。此为甲基红试验阳性。大肠杆菌分解丙酮酸的能力强，产酸多。可使pH下降到4.5，使指示剂变红，为大肠杆菌存在的M-R阳性；而产气肠杆菌，可把部分丙酮酸分解成乙酰甲醇(中性物质)，由于这个原因培养基pH可达5.4以上，使指示剂甲基红变为桔黄色，则可指示其中无大肠杆菌(阴性)。(2)试验方法：在两支装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管上分别标记好大肠杆菌、产气肠杆菌名称，并另做对照。按照无菌操作，接种于试验菌培养基中。37培养48h后，取出试验管。取两个空试管，每管加入以上对应的培养液5mL（此时无须无菌操作）。再加入5滴甲基红试剂。(3)结果：加入试剂后，培养基表层呈现红色：阳性(+)；培养基表