食品微生物检验技术.doc
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1、国家示范性高等职业院校建设成果食品微生物检验技术食品微生物检验技术课程组日照职业技术学院食品工程学院二零一零年八月无菌取样样品均质样品接种恒温培养结果观察样液稀释微生物检验基本流程图微生物实验室平面结构设计图前 言本教材是“教育部、财政部国家示范性高等职业院校建设项目-食品加工技术专业及专业群建设”的成果食品是人类赖以生存和发展的物质基础,食品安全问题是关系到人身健康和经济社会发展的重大问题。食品不同于其它工业产品的显著特点之一,就是在于它们很容易被微生物污染,而引起食物中毒或食源性传染疾病。因而,食品卫生质量,是食品企业质量管理工作的核心和重点,而食品质量监管体系中食品微生物检验技术是重要内
2、容,为了做到教、学、做一体化,实现学训同步,我们把过去的微生物检验技术的内容分为四个学习情境,即微生物观察技术学习情境,微生物培养技术学习情境,微生物检验实验室设计与管理和食品卫生微生物检验技术。微生物检验技术作为食品卫生检验与管理的重要组成部分,通过该课程的学习,使学生成为既能掌握食品卫生微生物学检验技术又能按照食品安全质量管理体系进行生产管理的高技能人才,基于此,我们组织了具有丰富专业理论和实践经验的8位教师和企业生产管理、检验技术人员组成课程组编写了食品微生物检验技术一书。食品微生物检验技术是高职高专食品类专业的一门重要职业岗位技术课,主要培养学生的食品卫生微生物学检验与实验室管理能力,
3、因此,本书在编写过程中始终贯穿了如下若干指导思想:1. 本教材编写过程中注意与生物化学、微生物学等学科前后知识的衔接,避免重复,突出了食品卫生检验与管理所涉及到相关内容的前后知识的有机结合与互相支撑,内容简洁不重复。强化了食品卫生微生物学检验技术,实验室建设与管理以及食品检验标准选择能力等方面知识的传授,注重实际操作技能的培养、内容上要满足学生职业能力拓展的需要。2. 根据食品卫生检验技术岗位的需要,将检验标准、检验技术和管理技术有机结合,避免了单纯讲检验技术而不讲标准与管理的弊端。内容上实现了理论与技能训练相结合,技术与检验标准相结合,检验与质量管理相结合,突出高职教育特色。3. 在编写形式
4、上,每一学习子情景开始都有学习目标,实训内容结束后有实验报告的编写与少而精的学导式思考题,以方便学生巩固知识、举一反三、活学活用。食品微生物检验技术是一门应用性很强的专业技术课,在编写内容上充分考虑这一特点,做到学训同步,尤其是在食品卫生微生物检验部分针对国家标准设计了综合实训以及企业实训项目,以培养学生对理论知识运用的综合能力。 本教材可以作为高职高专食品加工、食品营养与检测以及食品生物技术等专业的教材和食品卫生检验人员技能鉴定培训教材,也可以作为相关专业的科研人员及食品企业卫生检验、生产管理技术人员的参考资料。由于编者水平和时间有限,缺点和错误在所难免,请广大读者和同行专家提出宝贵意见。编
5、者2010.8 于日照职业技术学院泽厚园 目录学习情境一 微生物的观察技术- 1 -学习情境描述- 1 -子学习情境一 革兰氏染色法- 1 -子学习情境二 细菌的芽孢染色法- 4 -子学习情境三 酵母菌子囊孢子的观察- 7 -子学习情境四 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别- 9 -子学习情境五 四大类微生物菌落观察技术- 11 -学习情境二 微生物培养技术- 15 -学习情境描述- 15 -子学习情境一 淀粉水解- 15 -子学习情境二 微生物显微计数技术- 17 -子学习情境三 微生物生长曲线的测定- 21 -子学习情境四 IMVic与硫化氢试验- 23 -子学习情境五 糖发酵试验- 29
6、-子学习情境六 过氧化物酶测定- 31 -子学习情境七 微生物分离技术- 32 -学习情境三 食品微生物检验实验室设计与管理- 35 -学习情境描述- 35 -子学习情境一 编写一份实验报告- 36 -一、原始记录- 37 -(一)原始记录- 37 -二、试验设计- 38 -三、最近似值(MPN)计数法- 39 -子学习情境二 设计一个工厂微生物检验室- 41 -一、实验室的管理- 42 -二、实验室的认证认可- 42 -(一)认可与认证- 42 -(二)实验室认可原则- 43 -(三)实验室认可体系- 43 -(四)实验室认可的条件- 44 -(五)认可程序- 44 -学习情境四 食品卫生微
7、生物检验技术- 46 -子学习情境一 菌落总数的检验- 46 -子学习情境二 大肠菌群、粪大肠菌群- 50 -和大肠杆菌的检验与分析- 50 -子学习情境三 沙门氏菌的检验与分析- 56 -子学习情境四 金黄色葡萄球菌的检验与分析- 64 -子学习情境五 乳与乳制品卫生检验技术- 67 -子学习情境六 自来水微生物检验技术- 69 -子学习情境七 水产食品卫生微生物检验- 70 -子学习情境八 粮食中霉菌的检验技术- 72 -子学习情境九 肉与肉制品卫生检验- 73 -学习情境一 微生物的观察技术学习情境描述了解微生物的概念与分类;掌握原核微生物、真核微生物、病毒的形态结构;掌握微生物观察方法
8、并熟练完成实训项目。子学习情境一 革兰氏染色法【学习目标】1.学习并初步掌握革兰氏染色法。2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。【知识准备】一、基本原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的,而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂结晶紫进行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脱色,最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色),该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将
9、细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上,当用结晶紫初染后,像简单染色法一样,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低,用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙
10、醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征,为保证染色结果的正确性,采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。二、细菌细胞的细胞壁(cell wall)细胞壁是菌体细胞外壁,为细菌表面较复杂结构,是一层较厚(580nm)、质量均匀的网状结构,可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏。细胞壁坚韧而有弹性,使细菌具有一定的形态和保护菌体的作用。其主要作用表现在以下几个方面:固定细胞外形;协助鞭毛运动;保护细胞免受外力的损伤;为正常细胞分裂所必需;阻拦大
11、分子物质进入细胞(如革兰氏阴性细菌细胞壁可阻拦分子量超过800的抗生素透入);与细菌的抗原性、致病性(如内毒素)和对噬菌体的敏感性密切相关。在电子显微镜下观察细胞壁很明显,壁的外表面较内表面粗糙。细胞壁的厚度可以在电子显微镜下测定,例如,金黄色葡萄球菌为1550nm;大肠杆菌和雏白痢沙门氏菌(Salpullorum)为1015nm。图15细菌细胞的结构图1细胞质膜;2细胞壁;3荚膜;4异染颗粒;5纤毛;6鞭毛;7色素体;8脂质颗粒;9中体;10核糖体;11拟核;12横隔壁细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖、蛋白质和脂肪,有的还含有磷壁酸、脂多糖等物质。不同种类的细菌,其细胞壁成分和结构是不同的,故能
12、用染色法进行鉴别。革兰氏(Gram)染色法,就是微生物学中常用的鉴别细菌的染色法。染色时,先用碱性染料结晶紫着色,然后加碘液助染,再用酒精(乙醇)脱色,最后用复红等生物染料进行复染。经酒精处理不脱色,而被染成紫色者,称革兰氏阳性反应(G+);经酒精处理迅速脱色仅呈复染颜色(红色)者,称革兰氏阴性反应(G-)。革兰氏阴性细胞壁较薄,不含磷壁酸,肽聚糖含量较低,由于乙醇具有脂溶性,故使G-菌细胞壁增加通透性,从而使结晶紫一碘复合物析出而脱色。革兰氏阳性菌细胞壁较厚,含磷壁酸和大量肽聚糖,脂类含量低,在乙醇处理时,由于脱水作用而使肽聚糖结构层收缩,结构直径变小,通透性降低,结晶紫碘复合物被束缚在细胞
13、壁内,故不脱色,而为G+。革兰氏染色有着十分重要的理论与实践意义。通过这一染色,几乎可把所有的细菌分成革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌两个大类,因此,它是分类鉴定菌种时的重要指标。又由于这两大类细菌在细胞结构、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都呈现出明显的差异,因此,任何细菌只要通过简单的革兰氏染色,就可提供不少其他重要的生物学特性方面的信息。【工作任务】一、器材1菌种 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物,金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物,蜡样芽孢杆菌培养1220h营养琼脂斜面培养物。2染色剂革兰氏染色液。3仪器或其他用具 显微镜,酒精灯,载玻片,接种环,擦镜纸,生
14、理盐水,双层瓶等。二、操作步骤1制片取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色;涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性;火焰固定不宜过热(以玻片不烫手为宜)。2初染滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色12min,水洗。3媒染用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1nun,水洗。4脱色用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗。革兰氏染色结果是否正确,乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌,脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约2030s。5复染用番红液复染约2min,水洗
15、。6镜检干燥后,用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌,被染成红色的为革兰氏阴性菌。7混合涂片染色按上述方法,在同一载玻片上,以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。图1-1革兰氏染色程序1加草酸铵结晶染1nfim2水洗;3加碘液媒染lmin;4水洗,5己醇脱色约2030s,6水洗;7番红复染约2mira8水洗,9用吸水纸吸干三、实验报告1结果列表简述3株细菌的染色观察结果(说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。2思考题(1)你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么?(2)现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你
16、鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色,以证明你的染色结果正确性。(3)你的染色结果是否正确?如果不正确,请说明原因。(4)进行革兰氏染色时,为什么特别强调菌龄不能太老,用老龄细菌染色会出现什么问题?(5)革兰氏染色时,初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?(6)你认为革兰氏染色中,哪一个步骤可以省去而不影响最终结果?在什么情况下可以采用?子学习情境二 细菌的芽孢染色法【学习目标】1学习并掌握芽孢染色法。2初步了解芽孢杆菌的形态特征。【知识准备】一、基本原理芽孢又叫内生孢子(endospore),是某些细菌生长
17、到一定阶段在菌体内形成的休眠体,通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。由于芽孢壁厚、透性低、不易着色,当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时,菌体和芽孢囊着色,而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色,游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察,可用芽孢染色法。芽孢染色法的基本原理是:用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红,在加热条件下染色,使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内,进入菌体的染料经水洗后被脱色,而芽孢一经着色难以被永洗脱,当用对比度大的复染剂染色后,芽孢仍保留初染剂的颜色,而菌体和芽孢囊被
18、染成复染剂的颜色,使芽孢和菌体更易于区分。二、芽孢(germ)某些杆菌生长发育到一定阶段,当处于特定环境条件时,由胞浆胞质浓缩脱水后,在菌体内形成的一个折光性强、通透性低的坚实小体,叫细菌芽孢。在不同的细菌中,芽孢所处的位置不同,有的在中部,有的在偏端,有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形和圆柱形。带有芽孢的菌体称芽孢体,未形成芽孢的菌体称繁殖体。在细菌细胞内形成芽孢的性质是一些细菌的特征,在杆菌中只有两属是产生芽孢的:一种为芽孢杆菌属(Bacillus);另一种为梭状芽孢杆菌属(clostridium)。在球菌中只发现一种尿素八叠球菌(Sarcina ureae)是产生芽孢的。芽孢一般只在动物
19、体外才能形成,并受环境影响。当水分缺乏或营养物质不足,特别是碳源、氮源或磷酸盐不足时,容易形成芽孢。菌种不同其形成条件亦不同:如炭疽杆菌需要温度适宜(3032);厌氧芽孢杆菌需严格厌氧和营养丰富环境中才能形成芽孢。目前一般认为芽孢的形成是通过以下几个阶段(见图12)。图1-2细菌形成芽孢的过程脱水浓缩。菌体内细胞质在一定的生活阶段或由于环境条件的变化,大量失去水分,细胞内细胞质变得浓缩而集中在菌体的局部。芽孢形成过程中的吡啶-2,6-二甲酸含量高达芽孢干重的515,它以钙盐的形式存在。芽孢膜形成。菌体内浓缩的细胞质周围形成两层膜,即内膜和外膜。外膜结构比较紧密而坚硬,含有拟脂质,它能阻止菌体外
20、面水溶性物质及热力渗透进去。内膜在芽孢发芽时即形成繁殖体的细胞壁。芽孢游离。形成了芽孢的菌体不再繁殖,且处于休眠状态。以后菌体破裂,芽孢即游离出来。由上可知,芽孢是细菌处于代谢相对静止的休眠状态,以维持细菌生存的持久体。当环境条件适宜时,成熟的芽孢可被许多正常代谢物如丙氨酸、腺苷、葡萄糖、乳酸等激活而发芽,先是芽孢酶活化,皮质层及外壳迅速解聚,水分进入,在合适的营养和温度条件下,芽孢的核心向外生长成繁殖体,开始发育和分裂繁殖。一个芽孢只能形成一个菌体,故芽孢不是细菌的繁殖器官。芽孢对外界环境的抵抗力比繁殖体强得多,特别是耐高温和渗透压作用,一般化学药品也不容易渗透进去。主要表现在以下几个方面。
21、芽孢壁有多层结构,其通透性很低,特别是芽孢壳,无通透性,有保护作用,能阻止化学品渗入,所以消毒剂不能用于杀灭芽孢。芽孢含水量少(约40),其内的酶类和蛋白质不易遇热凝固变性,故短时高温仍不能杀灭芽孢(如破伤风芽孢可耐受13h煮沸)。芽孢形成时能合成一些特殊的酶,这些酶较之繁殖体中的酶具有更强的耐热性。如芽孢形成过程中很快合成大量DPA(吡啶二羧酸),同时也获得耐热性。DPA占芽孢干重的515,是芽孢所特有的成分,在细菌繁殖体和其他生物细胞中都没有。芽孢内酶活性与新陈代谢极低,故干燥和营养缺乏时可长时间存活。芽孢在土壤中可存活几年至几十年,故土壤中经常有破伤风梭菌芽孢和炭疽杆菌芽孢存在。芽孢在自
22、然界分布广泛,芽孢的抵抗力强,因此,要严防芽孢污染伤口、用具、敷料、手术器械等。用一般的化学消毒法不能彻底杀死芽孢。杀灭芽孢最有效的方法是高压蒸汽灭菌法。当进行消毒灭菌时往往以芽孢是否被杀死作为判断灭菌效果的指标。由于芽孢有以上几个特性,所以芽孢对不良环境有很强的抵抗力,可以保持生命力达数十年之久,在自然界使细菌度过恶劣的环境,在实验室是保存菌种的好材料。【工作任务】一、器材1菌种 蜡样芽孢杆菌约2d营养琼脂斜面培养物,球形芽孢杆菌(B.sphaericus)12d营养琼脂斜面培养物。2染色剂 5孔雀绿水溶液,0.5番红水溶液。3仪器或其他用具 小试管,滴管,烧杯,试管架,载玻片,木夹子,显微
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