《生物化学实验Ⅱ》实验教学大纲.doc

生物化学实验实验教学大纲生物化学实验 实验教学大纲 （Biochemical E_periments） 课程编号：1922021 课程名称：生物化学实验 实验学分：1 实验学时：32 适用专业：生物技术、生物科学、生物科学（师范）、生物工程 实验名称与学时安排 序号 实验名称 学时 分配 序号 实验名称 学时 分配 1 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量 8 4 糖酵解中间产物磷酸丙糖的鉴定 3 2 酵母 RNA 的提取、鉴定和定量测定 8 5 还原糖和总糖的测定 5 3 液化型淀粉酶活性测定 3 6 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用 5 实验一、SDS-聚丙烯胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量 实验性质：综合性实验 实验内容：（1）安装垂直板型电泳装置并制备凝胶 （2）蛋白质样品的预处理 （3）电泳以及电泳后的固定、染色与脱色 （4）M r 的计算 实验目的与要求：掌握 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理，巩固垂直板电泳的基本操作，并学会用该方法测定蛋白质的相对分子量 注意要点：（1）封胶一定要牢固，否则会导致漏胶；（2）分离胶及浓缩胶用水封时整个电泳槽要保持水平，否则会影响胶面的平整；（3）电泳时功率不宜太大，否则会因发热使玻璃板裂开；（4）染色及脱色过程放到摇床上进行可使染色及脱色更充分，但要注意摇床摇摆的幅度要适宜，不能是染色液及脱色液摇出，更不能伤及凝胶本身；（5）电泳完毕后电极缓冲液要分别回收再使用；（6）聚丙烯酰胺凝胶在没有聚合之前具有一定的神经毒性，并且能通过皮肤吸收，因此在操作过程中应避免与皮肤的直接接触，如不慎溅到应以流水反复冲洗。实验二、酵母 RNA 的提取和鉴定和定量测定 实验性质：综合性实验 实验内容：（1）酵母 RNA 的提取 （2）RNA 的鉴定 （3）消化炉的使用 （4）定磷法测定 RNA 的含量 实验目的与要求：掌握提取 RNA 的方法和 RNA 组成成分的鉴定方法，学习和掌握离心机的使用方法，掌握 RNA 含量的定磷法测定，学习和掌握消化炉的使用方法 注意要点：（1）从酵母中提取 RNA 时注意避免温度在 20-70间停留时间太长；（2）RNA 提取时用无水乙醚，所用量取的量筒必须干燥；（3）使用离心机时注意严格对称平衡，缓慢调节转速，待完全静止后方可取出样品；（4）RNA 样品消化时注意通风，并注意消化炉的使用安全；（5）分光光度法测定总磷与无机磷时注意各空白对照不可混淆。实验三、液化型淀粉酶活性测定 实验性质：验证性实验 实验内容：以单位时间内底物的减少测定液化型淀粉酶的活力 实验目的与要求：熟悉并掌握测定液化型淀粉酶活力的原理和方法 注意要点：（1）控制酶促反应的时间在 2-2.5 分钟之内，否则应改变稀释倍数重新测定；（2）所有试剂的量取均按照定量分析p 的要求操作；（3）记时必须准确；（4）实验在恒温（60）进行，pH6.0 相对恒定；（5）充分混匀试管中的各组分，使酶和底物充分接触。实验四、糖酵解中间产物磷酸丙糖的鉴定 实验性质：验证性实验 实验内容：通过碘乙酸对 3磷酸甘油醛脱氢酶抑制作用鉴定糖酵解中间产物磷酸丙糖 实验目的与要求：了解利用抑制剂来研究中间代谢的方法，通过一碘醋酸对 3磷酸甘油醛脱氢酶的抑制作用，进一步明确酶必需基团的概念 注意要点：（1）饱和 NaF 溶液对机体有毒，注意避免直接接触，严禁吸入；（2）反应液应过滤直至澄清，再进行成腙反应、对比颜色；（3）各试管保温之前必须充分摇匀；（4）加入三氯乙酸后要立即将试管内的液体充分混匀，及时终止酶促反应；（5）如果显色效果不明显可将碱化脱磷酸步骤放在苯腙生成后再进行。实验五、还原糖和总糖的测定 实验性质：综合性实验 实验内容：（1）葡萄糖标准曲线的制作 （2）样品中还原糖的提取 （3）样品总糖的水解及提取 （4）样品中含糖量的测定 实验目的与要求：学习用 3,5二硝基水杨酸比色法测定样品中的还原糖和总糖的含量，正确使用 721 分光光度计并熟练标准曲线的绘制 注意要点：（1）称量要准确；（2）标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色；（3）还原糖在 50恒温水浴中保温应不时搅拌，使还原糖浸出；（4）酸水解山芋粉应彻底。实验六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用 实验性质：综合性实验 实验内容：（1）肝匀浆的制备 （2）无氧情况下脱氢酶抑制作用的观察 实验目的与要求：掌握竞争性抑制作用的概念，了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的鉴定方法，进一步验证体内生物氧化过程中的递氢作用 注意点：（1）肝脏组织的匀浆过程应迅速，并保持温度较低以维持酶的活性；（2）应随时观察褪色情况，不同的组之间时间有可能有差异；（3）观察时不应剧烈摇荡试管，避免让空气中的氧重新将甲烯蓝氧化。实验教材：1、 扬州大学生物化学教研室主编生物化学实验（自编教材）、20_2 年 2、 张龙翔等主编生物化学实验方法和技术、人民教育出版社、1996 年 3、 李建武等主编生物化学实验原理与方法、北京大学出版社、1994 年 4、 丛峰松主编生物化学实验-生物科学实验系列教材、20_5 年 5、白玲、黄健主编基础生物化学实验、复旦大学出版社、20_4 年 第 3 页 共 3 页