薄芝糖肽结构组成分析_陆莹.pdf

1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology2007,14(5):364367薄芝糖肽结构组成分析3陆 莹1,金宇灏1,张慧慧2,倪扬林3,高向东13(1.中国药科大学 生命科学与技术学院,江苏 南京210009;2.南京普瑞医药生物技术有限公司,江苏 南京210036;3.扬州制药有限公司,江苏 扬州225009)摘 要 采取薄层层析法分析单糖组成,高效液相色谱法测定分子量及其分布,高碘酸氧化、Smith降解等方法确证糖苷键类型,紫外、Tricine2SDS2PAGE和 2消除等方法确证结合态蛋白的存在,利用柱前衍生化高效液相法测定氨基酸的组成,对薄芝糖肽(Ganoderma Capenseglycopeptide,GCGP)结构组成进行研究。结果:GCGP的多糖部分由葡萄糖组成,连接方式为16和12两种,含有结合态蛋白,氨基酸组成分析显示GCGP富含谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸,碱水解结果表明GCGP含微量色氨酸。糖肽连接方式初步定为O2连接。关键词 薄芝;糖肽;结构;组成;糖肽键中图分类号:S567.3+1 文献标识码:A 文章编号:100528915(2007)0520364204 薄芝为灵芝亚属真菌薄树芝的菌丝体,薄盖灵芝又称薄树芝Ganoderma Capense(Lloyd)Teng,是多孔菌科灵芝属真菌。主要活性成分是薄芝中的糖肽类成分,薄芝糖肽是由薄树芝菌丝体中分离纯化的含多肽组成的蛋白多糖体1,2。利用薄盖灵芝深层培养的菌丝体为原料制成的注射液,即薄芝糖肽注射液,对恶性肿瘤3、乙型肝炎4、硬皮病5、红斑狼疮6、斑秃7、特应性皮炎8、肌营养不良9、顽固性失眠10等疑难病症都有一定的疗效。作者对薄芝糖肽的结构和组成进行了研究。1 材 料1.1 仪器722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂);R2201旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司);TSP高效液相色谱仪:Thermo Separation Products;RID210A示差折光检测器;多糖专用GPC软件;紫外可见分光光度仪(北京瑞利分析仪器公司)。1.2 试剂牛血清白蛋白(南京生兴生物技术有限公司);单糖标准品:鼠李糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸(生物制品检定所);Folin酚试剂(南京大治生物科技有限公司);薄层层析硅胶G(青岛海洋化工有限公司);右旋糖苷(中国药品生物制品检定所);其它试剂皆为分析纯。1.3 样品薄芝糖肽粗品由扬州制药有限公司提供。薄芝糖肽粗品糖含量为64.7%,蛋白含量为29.2%。2 方 法2.1 薄芝糖肽粗品的纯化薄芝糖肽粗品经过Sephadex G225纯化,得精品薄芝糖肽(Ganoderma Capenseglycopeptide,GCGP)。采用蒽酮2硫酸法和Folin2酚法测定样品糖含量和蛋白含量。2.2 相对分子质量的测定2.2.1 采用高效液相色谱法(HPLC)测定GCGP的分子质量及其分布。2.2.2色谱条件 色谱柱:Bio2Sep2SEC2S2000凝胶柱(7.8 mm ID300 mm);流动相:0.7%Na2SO4溶液(内含0.02%NaN3);体积流量:0.5 ml/min;柱温:35;进样量:20l。2.2.3 供试品配制 取GCGP适量,用流动相配成每1 ml约含10 mg的样品溶液。2.3 单糖组分分析取GCGP 10 mg,用2 ml三氟乙酸溶解,转移至4633收稿日期:2007203208 修回日期:2007205216作者简介:陆莹,1982年生,女,汉族,硕士研究生,主要从事多糖药物研究。3 通讯作者:高向东,博导。Tel:025283271298 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/安瓿中,封口,100 水浴水解8 h,将水解液置于蒸发皿中蒸干,用1 ml甲醇洗涤蒸干,重复4次。用1 ml蒸馏水溶解洗涤后的固体,6 000 r/min6 min离心取上清备用。以正丁醇 丙酮 水=431作为展开剂,展开,取出,晾干,喷洒苯胺2邻苯二甲酸溶液,立即吹干,置于110 加热10 min显色。2.4 氨基酸组成分析柱前衍生化高效液相法测定氨基酸组成。酸水解:取1 mg样品,置水解管底部,加0.5 ml5.7 mol/L的HCl,反复冲入氮气后将其熔封,于110 水解24 h。冷却后加衍生化试剂后即可进样。碱水解:取1 mg样品,置水解管底部,加0.5 mol/L NaOH溶液(内含5%SnCl2),反复冲入氮气后将其熔封,于110 水解24 h。水解后切口,置冰浴中用5.7 mol/L的HCl中和,加衍生化试剂即可进样。Hp1050型高效液相色谱仪,V YDAC C18柱,25010 mm,样品溶于0.1%TFA,流动相:A:0.1%TFA;B:CH3CN,流速:1.6 ml/min,检测波长220 nm和280 nm,室温20。2.5 糖苷键类型的确证采用高碘酸氧化和Smith降解对GCGP的糖苷键类型进行确证11。2.5.1高碘酸氧化 精密称取干燥后的样品10 mg,溶解于15 mmol/L NaIO4溶液中,置4 暗处反应,间或振摇。于4、24、48 h 间隔时间取样,稀释250倍后,使用紫外分光光度仪在223 nm处测定吸光值。2.5.2Smith降解 取高碘酸氧化完全后的样品反应液加4 ml乙二醇,振摇30 min,脱盐、浓缩后加入50 mg NaBH4,置10 ml棕色容量瓶中,4 放置,48 h后取出,滴加乙酸以分解剩余硼氢化钠,置蒸发皿中75 水浴蒸干,加0.1%盐酸甲醇溶液2 ml,振荡后蒸干(重复4次),以除去硼酸根离子,剩余物加入4 ml 2 mol/L三氟乙酸(TFA)溶解后,分装于2支安瓿中,封口,100 水解8 h。开启安瓿,合并水解液置蒸发皿中蒸干,加甲醇1 ml以挥发三氟乙酸,重复4次,最后用1 ml蒸馏水溶解,得Smith降解产物。2.6 结合态蛋白的研究2.6.1 紫外光谱特征 将样品(1 mg/ml)进行全波长扫描。2.6.2Tricine2SDS2PAGE12采用Tricine2SDS2PAGE,考察GCGP的纯度及电泳行为。电泳结果采用两种染色方法:考马斯亮蓝染色法和甲苯胺蓝染色法。2.7GCGP糖肽键的鉴定 2消除反应13:将GCGP溶于0.4 mol/LNaOH水溶液中,于45 保温0.5 h,测定其紫外光谱,同时测定未用碱处理的同浓度的糖蛋白紫外光谱作为对照。3 结 果3.1 薄芝糖肽粗品纯化结果薄芝糖肽粗品纯化结果见图1。Fig 1Gel chromatography of GCGP on Sephadex G225根据峰形收集19230管,得到GCGP,测定结果显示,精品中糖含量为83.4%,蛋白含量为14.2%,回收率为82.5%。3.2HPLC测定结果高效液相色谱为单峰,表明组分纯度较高。分子量及其分布测定结果如图2,GCGP的相对分子质量为1 k。Fig 2Determination of the average molecular weight(Mw)of GCGP563陆 莹等:薄芝糖肽结构组成分析 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/3.3 单糖组分分析结果单糖组分分析结果如图3所示。GCGP酸水解产物显示一个斑点,根据与单糖标准品对照,其水解产物为葡萄糖。Fig 3TLC of hydrolysis products of GCGP3.4 氨基酸组成分析结果GCGP经水解,氨基酸组成分析结果表明,GCGP富含谷氨酸(40.7%)、丙氨酸(12.7%)、天冬氨酸(6.7%)、丝氨酸(4.3%)、甘氨酸(6.2%)、苏氨酸(4%)、缬氨酸(6.3%)、亮氨基酸(4.4%)、半胱氨酸(5.5%)。碱水解结果表明GCGP含微量色氨酸(0.3%)。3.5 糖苷键类型确证结果GCGP经高碘酸氧化,120 h高碘酸钠的消耗达到最大值。GCGP每单位葡萄糖残基消耗高碘酸钠1.13 mmol/L,生成甲酸量为0.79 mmol/L。高碘酸氧化产物经Smith降解后的薄层层析结果表明,产物中含有甘油和乙二醇,由此可以推断:GCGP中含有16和12糖苷键,根据高碘酸氧化的结果可以推算出16和12糖苷键之比为32。3.6 结合态蛋白的研究结果3.6.1 根据样品紫外光谱图所示(图4),样品在280 nm处有一肩峰,是蛋白的特征吸收峰,用于紫外扫描的GCGP是经过凝胶色谱层析处理的,除掉了游离蛋白,因此初步证明了结合态蛋白的存在。3.6.2Tricine2SDS2PAGE结 果 将GCGPTricine2SDS2PAGE结果同时进行考马斯亮蓝染色和甲苯胺蓝染色,结果显示单一条带,并且区带位置一致,如图5所示,证明GCGP纯度较高,并且含有结合态蛋白。Fig 4UV spectrum of GCGP1:Dyed with CBB G2250;2:Dyed with toluidine blueFig 5Tricine2SDS2PAGE of GCGP3.7 2消除反应结果碱处理后样品的紫外光谱在240 nm处吸光值有明显增加,如图6,说明GCGP中含有O2型糖肽键。Fig 6UV spectrum of GCGP after 2elimination4 讨 论GCGP的相对分子质量为1 k,采用常规的Tris2甘氨酸2SDS2PAGE分析时出现无着色带显示的问题,原因是常规Tris2甘氨酸2SDS2PAGE分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在10663药物生物技术第14卷第5期 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/200 k,对于相对分子质量小于10k的物质分辨率低,一些小分子在电泳分析过程中容易扩散丢失。GCGP的电泳分析采用了Tricine2SDS2PAGE,这是一种较为简便的分离小分子物质的方法。将电泳结果同时进行考马斯亮蓝染色和甲苯胺蓝染色,结果显示清晰单一的条带,并且区带位置一致,证明GCGP的纯度较高,并且含有结合态蛋白。2消除反应是指在稀碱溶液的作用下,O2型糖肽键能发生消去反应,与糖链连接的丝氨酸转化成 2氨基丙烯酸,苏氨酸转化为 2氨基丁烯酸,形成的不饱和氨基酸在240 nm左右处有明显吸收峰增加。本实验中,2消除反应后,240 nm处吸收值有明显增加,证明蛋白与糖是通过O2型糖肽键连接。参考文献 1 林永奇,付学奇,盖悦,等.薄芝糖肽的单糖组成分析 J.生物技术,2004,14:33.2 林永奇,魏化伟,刘挺,等.薄芝糖肽亲和层析纯化技术 J.生物技术,2004,14:31.3 李亚容,张素彦,胡春梅,等.薄芝糖肽治疗老年中晚期恶性肿瘤的临床观察J.中国老年学杂志,2004,24(9):807.4 许艳梅,贾洪树.薄芝糖肽单用及联合干扰素A21b治疗慢性乙型肝炎疗效观察J.临床内科杂志,2004,21(6):425.5 谢晶晖.薄芝注射液治疗硬皮病48例报告 J.中华皮肤科杂志,1986,19(5):289.6 肖永泽,孙曾拯.薄芝注射液治疗结缔组织病的临床观察J.湖北中医学院学报,2002,4(2):49.7 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weight(Mw).NaIO42oxidation and Smith degradationwere used to determine the structure.UV,Tricine2SDS2PAGE and 2elimination were used to identifythe glycopeptide linkage.Pre2column derivatization HPLC was used to determine the amino acid constit2uent of glycopeptide.The experiment showed that GCGP was composed of glucose,and its average mol2ecule weight was about 1k.The glycosidic linkage of GCGP was(16)(12)linking ways.Proteinwas testified in GCGP.It was homogeneous suggested by Tricine2SDS2PAGE method,which showed asingle band after staining with CBB G2250 and toluidine blue.The peptide chain of GCGP was mainlymade up of glycine,alanine,valine,leucine,cysteine,aspartic acid,glutamic acid,serine and threo2nine.There was O2glycopeptide linkage in GCGP.Key wordsGanoderma Capense(Lloyd)Teng,Glycopeptide,Structural,Composition,Glycopeptidelinkage763陆 莹等:薄芝糖肽结构组成分析