薄芝糖肽结构组成分析_陆莹.pdf
《薄芝糖肽结构组成分析_陆莹.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《薄芝糖肽结构组成分析_陆莹.pdf(4页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology2007,14(5):364367薄芝糖肽结构组成分析3陆 莹1,金宇灏1,张慧慧2,倪扬林3,高向东13(1.中国药科大学 生命科学与技术学院,江苏 南京210009;2.南京普瑞医药生物技术有限公司,江苏 南京210036;3.扬州制药有限公司,江苏 扬州225009)摘 要 采取薄层层析法分析单糖组成,高效液相色谱法测定分子量及其分布,高
2、碘酸氧化、Smith降解等方法确证糖苷键类型,紫外、Tricine2SDS2PAGE和 2消除等方法确证结合态蛋白的存在,利用柱前衍生化高效液相法测定氨基酸的组成,对薄芝糖肽(Ganoderma Capenseglycopeptide,GCGP)结构组成进行研究。结果:GCGP的多糖部分由葡萄糖组成,连接方式为16和12两种,含有结合态蛋白,氨基酸组成分析显示GCGP富含谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸,碱水解结果表明GCGP含微量色氨酸。糖肽连接方式初步定为O2连接。关键词 薄芝;糖肽;结构;组成;糖肽键中图分类号:S567.3+1 文献标识码:A
3、文章编号:100528915(2007)0520364204 薄芝为灵芝亚属真菌薄树芝的菌丝体,薄盖灵芝又称薄树芝Ganoderma Capense(Lloyd)Teng,是多孔菌科灵芝属真菌。主要活性成分是薄芝中的糖肽类成分,薄芝糖肽是由薄树芝菌丝体中分离纯化的含多肽组成的蛋白多糖体1,2。利用薄盖灵芝深层培养的菌丝体为原料制成的注射液,即薄芝糖肽注射液,对恶性肿瘤3、乙型肝炎4、硬皮病5、红斑狼疮6、斑秃7、特应性皮炎8、肌营养不良9、顽固性失眠10等疑难病症都有一定的疗效。作者对薄芝糖肽的结构和组成进行了研究。1 材 料1.1 仪器722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂);R2201旋
4、转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司);TSP高效液相色谱仪:Thermo Separation Products;RID210A示差折光检测器;多糖专用GPC软件;紫外可见分光光度仪(北京瑞利分析仪器公司)。1.2 试剂牛血清白蛋白(南京生兴生物技术有限公司);单糖标准品:鼠李糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸(生物制品检定所);Folin酚试剂(南京大治生物科技有限公司);薄层层析硅胶G(青岛海洋化工有限公司);右旋糖苷(中国药品生物制品检定所);其它试剂皆为分析纯。1.3 样品薄芝糖肽粗品由扬州制药有限公司提供。薄芝糖肽粗品糖含量为64.7%,蛋白含量为29.2%。2 方
5、 法2.1 薄芝糖肽粗品的纯化薄芝糖肽粗品经过Sephadex G225纯化,得精品薄芝糖肽(Ganoderma Capenseglycopeptide,GCGP)。采用蒽酮2硫酸法和Folin2酚法测定样品糖含量和蛋白含量。2.2 相对分子质量的测定2.2.1 采用高效液相色谱法(HPLC)测定GCGP的分子质量及其分布。2.2.2色谱条件 色谱柱:Bio2Sep2SEC2S2000凝胶柱(7.8 mm ID300 mm);流动相:0.7%Na2SO4溶液(内含0.02%NaN3);体积流量:0.5 ml/min;柱温:35;进样量:20l。2.2.3 供试品配制 取GCGP适量,用流动相配
6、成每1 ml约含10 mg的样品溶液。2.3 单糖组分分析取GCGP 10 mg,用2 ml三氟乙酸溶解,转移至4633收稿日期:2007203208 修回日期:2007205216作者简介:陆莹,1982年生,女,汉族,硕士研究生,主要从事多糖药物研究。3 通讯作者:高向东,博导。Tel:025283271298 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/安瓿中,封口,100 水浴水解8 h,将水解液置于蒸发皿中蒸干,用1 ml甲醇洗涤蒸干,重复4次。用1 ml
7、蒸馏水溶解洗涤后的固体,6 000 r/min6 min离心取上清备用。以正丁醇 丙酮 水=431作为展开剂,展开,取出,晾干,喷洒苯胺2邻苯二甲酸溶液,立即吹干,置于110 加热10 min显色。2.4 氨基酸组成分析柱前衍生化高效液相法测定氨基酸组成。酸水解:取1 mg样品,置水解管底部,加0.5 ml5.7 mol/L的HCl,反复冲入氮气后将其熔封,于110 水解24 h。冷却后加衍生化试剂后即可进样。碱水解:取1 mg样品,置水解管底部,加0.5 mol/L NaOH溶液(内含5%SnCl2),反复冲入氮气后将其熔封,于110 水解24 h。水解后切口,置冰浴中用5.7 mol/L的
8、HCl中和,加衍生化试剂即可进样。Hp1050型高效液相色谱仪,V YDAC C18柱,25010 mm,样品溶于0.1%TFA,流动相:A:0.1%TFA;B:CH3CN,流速:1.6 ml/min,检测波长220 nm和280 nm,室温20。2.5 糖苷键类型的确证采用高碘酸氧化和Smith降解对GCGP的糖苷键类型进行确证11。2.5.1高碘酸氧化 精密称取干燥后的样品10 mg,溶解于15 mmol/L NaIO4溶液中,置4 暗处反应,间或振摇。于4、24、48 h 间隔时间取样,稀释250倍后,使用紫外分光光度仪在223 nm处测定吸光值。2.5.2Smith降解 取高碘酸氧化完
9、全后的样品反应液加4 ml乙二醇,振摇30 min,脱盐、浓缩后加入50 mg NaBH4,置10 ml棕色容量瓶中,4 放置,48 h后取出,滴加乙酸以分解剩余硼氢化钠,置蒸发皿中75 水浴蒸干,加0.1%盐酸甲醇溶液2 ml,振荡后蒸干(重复4次),以除去硼酸根离子,剩余物加入4 ml 2 mol/L三氟乙酸(TFA)溶解后,分装于2支安瓿中,封口,100 水解8 h。开启安瓿,合并水解液置蒸发皿中蒸干,加甲醇1 ml以挥发三氟乙酸,重复4次,最后用1 ml蒸馏水溶解,得Smith降解产物。2.6 结合态蛋白的研究2.6.1 紫外光谱特征 将样品(1 mg/ml)进行全波长扫描。2.6.2
10、Tricine2SDS2PAGE12采用Tricine2SDS2PAGE,考察GCGP的纯度及电泳行为。电泳结果采用两种染色方法:考马斯亮蓝染色法和甲苯胺蓝染色法。2.7GCGP糖肽键的鉴定 2消除反应13:将GCGP溶于0.4 mol/LNaOH水溶液中,于45 保温0.5 h,测定其紫外光谱,同时测定未用碱处理的同浓度的糖蛋白紫外光谱作为对照。3 结 果3.1 薄芝糖肽粗品纯化结果薄芝糖肽粗品纯化结果见图1。Fig 1Gel chromatography of GCGP on Sephadex G225根据峰形收集19230管,得到GCGP,测定结果显示,精品中糖含量为83.4%,蛋白含量
11、为14.2%,回收率为82.5%。3.2HPLC测定结果高效液相色谱为单峰,表明组分纯度较高。分子量及其分布测定结果如图2,GCGP的相对分子质量为1 k。Fig 2Determination of the average molecular weight(Mw)of GCGP563陆 莹等:薄芝糖肽结构组成分析 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/3.3 单糖组分分析结果单糖组分分析结果如图3所示。GCGP酸水解产物显示一个斑点,根据与单糖标准品对照,其水
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 糖肽 结构 组成 分析 陆莹
限制150内