PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测.pdf

实验五 PCR 扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的1.掌握 PCR 扩增技术的基本原理2.掌握 PCR 的常规操作3.熟悉 PCR 反应体系中几种主要成分的作用4.了解 PCR 技术的应用5.掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物的方法6.熟悉 DNA 在电泳过程中迁移率的决定因素二、实验原理1.PCR 基本原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称 PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增 DNA，类似 DNA 的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链 DNA 变性为单链 DNA、单链 DNA 能与引物复性（退火）成为引物-DNA 单链复合物、以及在 dNTPs 存在下 DNA 聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链 DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个 PCR 循环；一般通过 20-30 个循环之后，就可获得大量（10 倍）的要扩增的 DNA 片段。PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环“变性退火延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。62.PCR 反应体系标准 PCR 反应体系10 x 扩增缓冲液4 种 dNTP 混合液引物模版 DNATaq DNA 聚合酶Mg2+双蒸水3.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA 片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA 分子在高于其等电点的 pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形 DNA 分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入 DNA 的碱基之间，形成一种光络合物，在 254365nm 波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的 DNA 进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：增大样品密度，确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；以 TBE 做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长 700bp的双链 DNA 相同，二甲苯氰（蓝）则与2Kbp 的 DNA 相同。三、实验仪器、材料和试剂1.仪器：移液器、离心管、PCR 仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统2.材料：模版 DNA 引物3.试剂：dNTP TaqDNA 聚合酶 buffer四、实验步骤1.按照以下顺序，依次添加入PCR 管内ddH2O ul10 x buffer 5ul10 ul200ul10100ul2ugL100uldNTP引物 +ul模版 2 ulTaq 酶2.将配制好的 PCR 体系充分混匀后，离心。3.盖紧 PCR 管的盖子，插入 PCR 仪的孔内。4.设定好程序，开始 PCR 反应。5.PCR 反应结束后，对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。五、注意事项1.换枪头，避免污染试剂2.酶置于冰上，且最后加入体系中。3.PCR 管的盖子一定要盖紧，以防蒸干。4.琼脂糖凝胶电泳，方向为阴极阳极。5.一定要戴手套保护自己。六、思考题1.PCR 反应体系中主要成分有哪些他们分别起什么作用2.为什么在 PCR 过程中要使用三个不同的温度3.用 PCR 扩增目的基因，如何提高产物的特异性4.DNA 在电泳过程中的迁移率取决于哪些因素