PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测.pdf
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1、实验五 PCR 扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的1.掌握 PCR 扩增技术的基本原理2.掌握 PCR 的常规操作3.熟悉 PCR 反应体系中几种主要成分的作用4.了解 PCR 技术的应用5.掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物的方法6.熟悉 DNA 在电泳过程中迁移率的决定因素二、实验原理1.PCR 基本原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),简称 PCR,是一种分子生物学技术,用于在体外快速扩增 DNA,类似 DNA 的细胞内复制过程:由一对引物介导,通过温度的调节,使双链 DNA 变性为单链 DNA、单链 DNA 能与引物复性(退火)成为引物-DNA 单
2、链复合物、以及在 dNTPs 存在下 DNA 聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链 DNA(引物的延伸);这种热变性-复性-延伸的过程,就是一个 PCR 循环;一般通过 20-30 个循环之后,就可获得大量(10 倍)的要扩增的 DNA 片段。PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:模板 DNA 的变性:模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板 DNA 与引物的退火(复
3、性):模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环“变性退火延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟,23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。62.PCR 反应体系标准 PCR 反应体系10 x 扩增缓冲液4 种 dNTP 混合液引物模版 DNATaq DNA 聚合酶M
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