硝酸还原酶活性的测定.ppt

硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶活性的测定一、目的一、目的v硝酸还原酶（硝酸还原酶（NR）是硝酸盐同化中第一个酶，）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。作为品种选育的指标之一。v通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。性的原理和方法。v离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加受损失，必需外加NADH方可测定。方可测定。v活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后，被硝酸还原酶还原成进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO2-并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO2-的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。v活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADHNADH可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。v本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。二、原理v硝酸还原酶可将硝酸还原酶可将NO3-还原成还原成NO2-：vNO3-+NADH+H+NR NO2-+NAD+H2Ov在一定条件下，在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。活性呈正相关。NO2-含量可用磺胺显色法测含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与定，即在酸性条件下与对对-氨基苯磺酸胺氨基苯磺酸胺发生发生重氮反应，生成的重氮反应，生成的重氮化合物重氮化合物又与又与N-萘基乙萘基乙二胺盐酸盐（或二胺盐酸盐（或-萘胺萘胺）生成）生成红色偶氮化合红色偶氮化合物物，可在，可在520nm下比色测定。下比色测定。植物植物 对对-氨基苯磺酸胺氨基苯磺酸胺 NO NO3 3-NO NO2 2-重氮化合物重氮化合物 -萘胺萘胺 比色比色 红色偶氮化合物红色偶氮化合物 520nm 520nm三、实验材料、仪器1 1材料材料 小油菜小油菜2 2仪器仪器 （1 1）天平）天平 （2 2）注射器）注射器 （3 3）试管）试管 （4 4）50mL50mL三角瓶三角瓶33 （5 5）恒温箱）恒温箱 （6 6）分光光度计）分光光度计四、试剂四、试剂1.亚硝酸钠标准溶液亚硝酸钠标准溶液5g/mL NaNO2 0.1g定容至定容至100mL，取其中，取其中2.5mL稀稀释定容至释定容至500mL，即为，即为5g/mL浓度的浓度的NaNO2标准液标准液2.硝酸钾标准溶液硝酸钾标准溶液0.2mol/L KNO3 2.02g用磷酸缓冲溶液稀释定容至用磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，即为，即为0.2mol/L的的KNO3标准液标准液3.1%对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸 对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸1g，加浓盐酸，加浓盐酸25mL，用，用蒸馏水定容至蒸馏水定容至100mL；共配制；共配制2次，次，200mL4.0.2%-萘胺萘胺 -萘胺萘胺0.2g，加冰乙酸，加冰乙酸25mL，用蒸馏水，用蒸馏水定容至定容至100mL；共配制；共配制2次，次，200mL5.30%三氯乙酸三氯乙酸 三氯乙酸三氯乙酸30g，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至100mL五、操作步骤五、操作步骤1 1酶反应和酶活性的测定酶反应和酶活性的测定 将实验材料使用打孔器打成圆片，混合均将实验材料使用打孔器打成圆片，混合均匀后分别称取匀后分别称取2 2份，每份份，每份1g1g左右，编号后按左右，编号后按表表2 2加入各种试剂：加入各种试剂：三角瓶号三角瓶号三角瓶号三角瓶号 1 2 1 2 1 2 1 2 0.2mmol/L 0.2mmol/L 0.2mmol/L 0.2mmol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（mLmLmLmL）4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 0.2mmol/LKNO 0.2mmol/LKNO 0.2mmol/LKNO 0.2mmol/LKNO3 3 3 3溶液（溶液（溶液（溶液（mLmLmLmL）5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 30%30%30%30%三氯乙酸（三氯乙酸（三氯乙酸（三氯乙酸（mLmLmLmL）1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0+在针筒中进行反复抽气，直到放气后叶片变在针筒中进行反复抽气，直到放气后叶片变软并沉入溶液；将针筒中混合溶液和叶片取软并沉入溶液；将针筒中混合溶液和叶片取出放入编号三角瓶中，在出放入编号三角瓶中，在30、暗条件下保、暗条件下保温温30min；取出后立即向；取出后立即向2号瓶加入号瓶加入1mL 30%三氯乙酸以终止酶反应。三氯乙酸以终止酶反应。v 然后分别吸取上清液然后分别吸取上清液1mL于另一试管中，于另一试管中，各加入各加入2mL 1%对氨基苯磺酸和对氨基苯磺酸和2mL 0.2%-萘胺萘胺（注意顺序）（注意顺序），室温显色，室温显色30min后测定后测定520nm波长下的光密度波长下的光密度v 用用2号管溶液光密度平均值减去号管溶液光密度平均值减去1号管溶液号管溶液的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应的的NaNO2含量（含量（g）2标准曲线的制作标准曲线的制作 取取6支干净试管，编号，按表支干净试管，编号，按表1加入试剂：摇匀后加入试剂：摇匀后在室温下放置在室温下放置30min，然后在，然后在520nm波长下测定波长下测定光密度，以光密度，以亚硝酸含量亚硝酸含量和和光密度值光密度值绘制标准曲线绘制标准曲线(按顺序加试剂按顺序加试剂)取样取样 称量、编号称量、编号 加缓冲溶液加缓冲溶液 暗处保温暗处保温 抽气抽气 测吸光光度值测吸光光度值 显色反应显色反应 取取1mL1mL 计算含量计算含量绘制亚硝酸钠绘制亚硝酸钠 标准曲线标准曲线六、结果与计算六、结果与计算v把在标准曲线上查得的把在标准曲线上查得的NaNONaNO2 2含量代入下式，含量代入下式，计算硝酸还原酶活性：计算硝酸还原酶活性：NaNO2含量含量(g)稀释倍数稀释倍数NR活性活性NaNO2(g)/鲜重鲜重(g)h=样品重样品重(g)时间时间(h)七、思考题v1 1为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入真空干燥器抽气？真空干燥器抽气？v2 2为什么为什么1 1号三角瓶在加入样品之前就要先号三角瓶在加入样品之前就要先加入加入1.0ml 30%1.0ml 30%三氯乙酸？三氯乙酸？