硝酸还原酶活性的测定.ppt
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1、硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶活性的测定一、目的一、目的v硝酸还原酶(硝酸还原酶(NR)是硝酸盐同化中第一个酶,)是硝酸盐同化中第一个酶,也是限速酶,处于植物氮代谢的关键位置。也是限速酶,处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关,对农作物产量它与植物吸收利用氮肥有关,对农作物产量和品质有重要影响,因而硝酸还原酶活性被和品质有重要影响,因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一,也可当作植物营养或农田施肥的指标之一,也可作为品种选育的指标之一。作为品种选育的指标之一。v通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。性的原理和方法。
2、v离体法需将材料磨成匀浆,经过滤或离心除离体法需将材料磨成匀浆,经过滤或离心除去残渣,以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行去残渣,以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中测定。由于研磨中NADH受损失,必需外加受损失,必需外加NADH方可测定。方可测定。v活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后,被硝酸还原酶还原成进入细胞后,被硝酸还原酶还原成NO2-并扩散到细胞外在溶液中积累,测定溶液中并扩散到细胞外在溶液中积累,测定溶液中NO2-的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。v活体法不破坏细胞原有的酶反应系统,
3、活体法不破坏细胞原有的酶反应系统,NADHNADH可由代谢反应不断生成,无需外加。活体法可由代谢反应不断生成,无需外加。活体法简便、快速,不需要贵重仪器设备及低温条简便、快速,不需要贵重仪器设备及低温条件,但重复性欠佳,应作一定量的重复。件,但重复性欠佳,应作一定量的重复。v本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。二、原理v硝酸还原酶可将硝酸还原酶可将NO3-还原成还原成NO2-:vNO3-+NADH+H+NR NO2-+NAD+H2Ov在一定条件下,在一定条件下,NO2-的生成量与硝酸还原酶的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。活性呈正相关。NO2-含量可用磺胺显
4、色法测含量可用磺胺显色法测定,即在酸性条件下与定,即在酸性条件下与对对-氨基苯磺酸胺氨基苯磺酸胺发生发生重氮反应,生成的重氮反应,生成的重氮化合物重氮化合物又与又与N-萘基乙萘基乙二胺盐酸盐(或二胺盐酸盐(或-萘胺萘胺)生成)生成红色偶氮化合红色偶氮化合物物,可在,可在520nm下比色测定。下比色测定。植物植物 对对-氨基苯磺酸胺氨基苯磺酸胺 NO NO3 3-NO NO2 2-重氮化合物重氮化合物 -萘胺萘胺 比色比色 红色偶氮化合物红色偶氮化合物 520nm 520nm三、实验材料、仪器1 1材料材料 小油菜小油菜2 2仪器仪器 (1 1)天平)天平 (2 2)注射器)注射器 (3 3)试
5、管)试管 (4 4)50mL50mL三角瓶三角瓶33 (5 5)恒温箱)恒温箱 (6 6)分光光度计)分光光度计四、试剂四、试剂1.亚硝酸钠标准溶液亚硝酸钠标准溶液5g/mL NaNO2 0.1g定容至定容至100mL,取其中,取其中2.5mL稀稀释定容至释定容至500mL,即为,即为5g/mL浓度的浓度的NaNO2标准液标准液2.硝酸钾标准溶液硝酸钾标准溶液0.2mol/L KNO3 2.02g用磷酸缓冲溶液稀释定容至用磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL,即为,即为0.2mol/L的的KNO3标准液标准液3.1%对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸 对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸1g,加浓盐酸,加浓盐酸25mL
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- 硝酸 还原酶 活性 测定
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