实验三硝酸还原酶活性测定.ppt
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1、实验实验3 3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶(酶(NRNR)活性的影响)活性的影响硝酸还原酶硝酸还原酶植植物物从从土土壤壤中中吸吸收收的的NONO3 3必必须须经经代代谢谢性性还还原原才才能能被被利利用用,因因为为细细胞胞组组分分中中的的N N均均呈呈高高度度还还原原态态,而而NONO3 3中中的的N N为为高高度度氧氧化化态态。硝硝酸酸盐盐的的还还原原由由硝硝酸酸还还原原酶酶(nitrate(nitrate reductasereductase,NR)NR)催催化化。硝酸还原酶存在于细胞液中,为一种诱导酶。硝酸还原酶存在于细胞液中,为一种诱导酶。诱诱导导酶酶(induc
2、ed(induced enzyme):enzyme):植植物物体体本本来来不不含含有有,但但在在特特定定外外来来物质物质(如底物如底物)的诱导下的诱导下,可以产生的酶。可以产生的酶。受光促进受光促进1.实验目的意义实验目的意义 掌握硝酸还原酶活性的测定方法掌握硝酸还原酶活性的测定方法了解硝酸还原酶的特性了解硝酸还原酶的特性硝酸还原酶(,缩写硝酸还原酶(,缩写NR)是硝酸盐同化中第一个酶,也)是硝酸盐同化中第一个酶,也是限速酶,处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利是限速酶,处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关,对农作物产量和品质有重要影响,因而硝酸用氮肥有关,对农作物产量和品质
3、有重要影响,因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一,也可还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一,也可作为品种选育的指标之一。作为品种选育的指标之一。硝酸还原硝酸还原酶可将酶可将NO3-还原成还原成NO2-,其反应为:,其反应为:NO3-+NADH+H+NO2-+NAD+H2ONR 在在一一定定条条件件下下,NO2-的的生生成成量量与与NR的的活活性性呈呈正正相相关关,因此,可以通过因此,可以通过测定测定NO2-的生成量来代表的生成量来代表NR的活性的活性。2.实验原理实验原理 NONO2 2-含量测定(磺胺比色法)含量测定(磺胺比色法)含量测定(磺胺比色法)含量测定(磺胺比
4、色法)在在酸酸性性溶溶液液中中,NO2-与与磺磺胺胺形形成成重重氮氮盐盐,重重氮氮盐盐再再与与-萘萘胺胺偶偶联联,形形成成紫紫红红色色的的偶偶氮氮化化合合物物。该该偶偶氮氮化化合合物物在在540nm有最大吸收峰,可以用分光光度计测定(有最大吸收峰,可以用分光光度计测定(OD540)。)。(!(!不稳定,见光容易分解,测定需迅速。不稳定,见光容易分解,测定需迅速。)当磺胺与当磺胺与-萘胺均过量时,所生成的红色深浅与萘胺均过量时,所生成的红色深浅与NO2-含量成含量成直线关系。直线关系。NO2-含量标准曲线:含量标准曲线:NO2-(540 NR活性活性(NO2-,mol/hgfw)=鲜重鲜重(g)
5、时间时间(h)NO2-(mol/ml)稀释倍数稀释倍数离离体体法法:将将材材料料磨磨成成匀匀浆浆,经经过过滤滤或或离离心心除除去去残残渣渣,以以上上清清液液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。为硝酸还原酶粗酶液进行测定。缺点:缺点:由于研磨中由于研磨中NADH受损失,必需外加受损失,必需外加NADH方可测定。方可测定。活活体体法法:直直接接用用鲜鲜活活组组织织进进行行测测定定。环环境境中中的的NO3-进进入入细细胞胞后后被被NR还还原原成成NO2-,并并扩扩散散到到细细胞胞外外在在溶溶液液中中积积累累,测测定溶液中定溶液中NO2-的含量即可得知的含量即可得知NR的大小。的大小。优优点点:不不破破坏坏细
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