DNS法淀粉含量测定388.pdf

淀粉含量测定 侯曼玲，食品分析，化学工业出版社，北京，2004 1 实验原理 样品经除去脂肪和可溶性糖类后，其中的淀粉用酸水解成具有还原性的单糖，然后按还原糖测定，并折算成淀粉。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖、麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。2.材料与方法 2.1 实验材料 谷物种子 2.2 主要仪器 本实验用到的实验仪器有：具塞玻璃刻度比色管：25mL19；烧杯：100mL4；三角瓶：100mL1；容量瓶：100mL3，50mL3；刻度吸管：1mL4；2mL3；10mL1；沸水浴；冰浴；扭力天平；721 型可见分光光度计 2.3 实验试剂 乙醚，乙醇溶液(=85%)，HCl 溶液(1+1)，NaOH 溶液：配制的质量浓度分别为 10%和 40%，Pb(Ac)2 溶液(200g/L)，Na2SO4 溶液(100g/L)甲基红指示剂(2g/L)溶解 0.2g 甲基红于 60mL 乙醇中，加水稀释至 100mL 1mg/mL 葡萄糖标准液 准确称取 80烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4冰箱中保存备用。3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 将 6.3g DNS 和 262mL 2M NaOH 溶液，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至 1000mL，贮于棕色瓶中备用。2.4 实验步骤 制作葡萄糖标准曲线 取 7 支 25mL 具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/mL 葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540nm）0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 7 1.4 0.6 1.5 1.4 8 1.6 0.4 1.5 1.6 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至 25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm，用0 号管调零点，测出 16 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，做出标准曲线。样品处理 准确称取2-5g磨碎、过40目筛的样品，置于放有慢速滤纸的漏斗中，用30mL乙醚分三次洗去样品中的脂肪，弃去乙醚。再用乙醇溶液约 150mL 分数次洗涤残渣，以除去可溶性糖类。滤干乙醇后用 100mL 水将残渣转入 250mL 锥形瓶中，加入盐酸(1+1)30mL，连接好冷凝管，置沸水浴中回流 2h。回流完毕后，立即置流动水中冷却至室温，加入 2 滴甲基红指示剂，将水解液调至近中性(先用 40%NaOH 溶液调至黄色，再用盐酸(1+1)校正至水解液刚变红色为宜；若水解液颜色深，可用精密 pH 试纸测试，调至 pH 约为 7)。加中性Pb(Ac)2 溶液 20mL，摇匀。放置 10min，使蛋白质等干扰物质沉淀完全。再加等量的 Na2SO4 溶液，以除去多余的铅盐。摇匀后将全部溶液及残渣转入 500mL容量瓶中，用水洗涤锥形瓶，洗液合并于容量瓶中。用水定容至刻度，混匀、过滤(初滤液弃去)。样品中含糖量的测定 取 7 支大试管，分别按下表加入各种试剂：管号 空白 1 2 3 4 5 6 数量 项目 样品量(ml)0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 蒸馏水(ml)2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 DNS 试剂(ml)1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 加热 均在沸水浴中加热 5min 冷却 立即用液动冷水冷却 蒸馏水(ml)21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 光密度(D540)将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式推算出谷物种子内还原糖与总糖的百分含量。100%样品重量样品稀释倍数还原糖毫克数还原糖 100%样品重量样品稀释倍数水解后还原糖毫克数总糖量