BJS201711畜肉中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因的测定.doc

1附件 2畜畜肉肉中中阿阿托托品品、山山莨莨菪菪碱碱、东东莨莨菪菪碱碱、普普鲁鲁卡卡 因因和和利多卡因利多卡因的测定BJS 2017111 范围本方法规定了畜肉中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于畜类肌肉组织中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因的定性确证和定量测定。2 原理用磷酸盐缓冲溶液提取畜类肌肉组织中阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因，提取液经离心、净化后用液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。3 试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯，水应为符合 GB/T 6682 规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。3.1.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。3.1.4 乙酸（CH3COOH）：色谱纯。3.1.5 正己烷（C6H14）：色谱纯。3.1.6 氢氧化钠（NaOH）。3.1.7 磷酸二氢钾（KH2PO4）。3.1.8氨水（NH3·H2O）。3.2 试剂的配制3.2.1 氢氧化钠溶液（200 g/L）：称取氢氧化钠（3.1.6）20g，加适量的水溶解，冷却后加水稀释至100 mL，混匀。3.2.2 磷酸二氢钾缓冲溶液（0.1mol/L）：称取磷酸二氢钾（3.1.7）13.6g，加水溶解至近1000 mL，用氢氧化钠溶液（3.2.1）调节pH至4.0，加水定容至1000 mL，混匀。3.2.3 甲酸溶液（2 mL/100 mL）：移取甲酸（3.1.3）2 mL，加水稀释至 100 mL，混匀。3.2.4 氨水甲醇溶液（2+98）：移取氨水（3.1.8）2 mL，加甲醇（3.1.1）稀释至 100 mL，混匀。3.2.5 乙酸溶液（0.1 mL/100 mL）：移取乙酸（3.1.4）1 mL，加水稀释至 1000 mL，混匀。3.2.6 甲酸溶液（0.1 mL/100 mL）：移取甲酸（3.1.3）1 mL，加水稀释至 1000 mL，混匀。3.3 标准品硫酸阿托品、消旋山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因标准品的中文名称、英2文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量和折算系数见附录A表A.1，纯度均98%。3.4 标准溶液的配制3.4.1 标准储备液（100 mg/L）：准确称取标准品（3.3），分别折算成含阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因10 mg（精确至0.0001 g），置于100 mL烧杯中，加适量的甲醇（3.1.1）溶解，并用甲醇转移并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为100 mg/L标准储备液。置-18 以下冰箱中保存，有效期6个月。3.4.2 标准中间液（1.00 g/mL）：移取标准储备液（3.4.1）1.00 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇（3.1.1）定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1.00 g/mL标准工作液。置于48保存，有效期3个月。3.4.3 标准工作溶液：临用现配。3.5 SPE小柱：Oasis MCX阳离子交换柱，60mg/3mL，或性能相当者。4 仪器和设备4.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。4.2 均质器。4.3 高速冷冻离心机：转速10000 r/min。4.4 固相萃取装置。4.5 涡旋混合器。4.6 超声波清洗器。4.7 氮气吹干仪。4.8 电子天平：感量分别为 0.01 g 和 0.000 1 g。4.9 pH 计:精度 0.01。5 测定步骤5.1 试样的制备与保存取空白或供试肌肉组织，绞碎，并使均质，得空白或试样。5.2 试样的处理5.2.1 提取称取试样 5 g（精确至 0.01g）于 50 mL 具塞离心管中，加入磷酸二氢钾缓冲溶液（3.2.2）20 mL ，加盖后涡旋 2 min，再超声处理 15 min， 4以下 10000 r/min 离心 15min，上清液倒入另一离心管中。残渣中再加入缓冲溶液 20 mL，重复提取一次，合并上清液，滤纸过滤，用上述缓冲溶液 4 mL 洗涤滤纸，收集全部滤液于 50 mL 容量瓶中，用缓冲溶液定容至 50 mL，待净化。5.2.2 净化Oasis MCX 阳离子交换柱使用前依次用 3 mL 甲醇（3.1.1）、3 mL 水和 3 mL 甲酸溶液（3.2.3）活化，保持柱体湿润。取待净化液 5.00 mL 加入 SPE 小柱（3.5），流速控制在 1 mL/min 内，依次用 3 mL 甲酸溶液、3 mL 甲醇、3mL 正己烷（3.1.5）淋洗小柱，弃去全部流出液，在 65 kpa 的负压下，抽干 2 min，最后用氨水甲醇溶液（3.2.4）5 mL 洗脱，收集洗脱液。洗脱液在 40以下氮气吹干，加入甲酸溶液（3.2.6）1.00mL，涡旋 0.5 min，过 0.22 m 滤膜，供测定。35.3 标准工作溶液的制备称取空白试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管中，分别加入标准中间液（3.4.2）适量，使其浓度为0.500、1.00、2.00、5.00、10.0、50.0 ng/mL，经5.2步骤操作，供测定。注:可根据仪器的灵敏度及样品中待测物的实际含量确定标准系列溶液浓度。5.4 液相色谱-串联质谱测定5.4.1 液相色谱参考条件a.色谱柱：C18色谱柱（2.1 x 50 mm，1.8 µm），或性能相当者。b.流动相：A：乙腈（3.1.2），B：乙酸溶液（3.2.5），梯度洗脱条件见表1。表1 梯度洗脱条件时间（min）A（%）B（%）0.010901.010903.017833.590104.010905.01090c.柱温：30 。d.流速：0.4 mL/min。e.进样量：5 L。5.4.2 质谱参考条件a.扫描方式：正离子扫描；b.采集方式：MRM采集方式；c.电离电压：3.0 kV；d.脱溶剂温度：450 ；e.定性离子对、定量离子和碰撞能量见表 2。表 2 待测物质的定性离子、定量离子和碰撞能量中文名称母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞能量(eV)阿托品290124*；9322/30山莨菪碱306140*；12225/30东莨菪碱304138*；15618/20普鲁卡因237100*；12016/30利多卡因23586*；5820/40注：*为定量离子。5.5 定性测定4按照上述条件测定试样和混合标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与混合标准测定溶液中的某种组分一致（变化范围在±2.5%之内）；试样中定性离子对的相对丰度与浓度相当混合标准测定溶液的相对丰度一致，相对丰度（k）偏差不超过表 3 规定的范围，则可判定为试样中存在该组分。表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（%）k>50%50%k>20%20%k>10%k10%允许的最大偏差（%）± 20± 25± 30± 505.6 定量测定5.6.1 标准曲线的制作将混合标准测定溶液（5.3），分别按仪器参考条件（5.4）进行测定，得到相应的峰面积。以浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.6.2 试样溶液的测定将试样溶液（5.2.2），按仪器参考条件（5.4）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到试样测定溶液中待测组分的浓度，平行测定两次；试样待测液响应值若低于标准曲线线性范围，应视为未检出；标准品多反应监测（MRM）色谱图参见附录 B 的图 B。5.7 空白试验除不加试样外，均按上述步骤操作。6 结果计算与表述试样中各待测组分的残留量按式（1）计算：.(1)式中：X试样中各待测组分的残留量，单位为微克每千克（g/kg）C试样测定溶液中各待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）V定容体积，单位为毫升（mL）m试样的取样量，单位为克（g）f样品的稀释倍数计算结果需扣除空白值，测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。7 检测方法灵敏度、准确度、精密度7.1 灵敏度本方法在畜肉中的检出限均为0.5 g/kg。7.2 准确度本方法在0.5 g/kg5.0 g/kg的添加水平上的回收率范围为83.2%100.3%。7.3 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。1000 1000C VXfm5本方法批内相对标准偏差20%，批间相对标准偏差20%。附录A标准品信息表A.1 标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量和折算系数序 号中文名称英文名称CAS 登录号分子式相对分 子量折算 系数1硫酸阿托品Atropine sulfate55-48-1(C17H23NO3)2·H2SO4676.820.8552消旋山莨菪碱Anisodamine17659-49-3C17H23NO4305.371.0003氢溴酸东莨菪碱Scopolamine Hydrobromide6533-68-2C17H28BrNO7438.310.6924普鲁卡因Procaine59-46-1C13H20N2O2236.321.0005利多卡因Lidocaine137-58-6C14H22N2O234.341.0006附录 B标准品多反应监测（MRM）色谱图+ MRM (237.0 -> 100.0) STD5.dAcquisition Time (min)0.511.522.5Counts5x10012345670.842 min.Acquisition Time (min)0.4 0.6 0.811.2 1.4 1.6Relative Abundance (%)2x1000.20.40.60.81237.0 -> 100.0 , 237.0 -> 120.0Ratio = 82.1 (99.0 %)普鲁卡因+ MRM (306.0 -> 140.0) STD5.dAcquisition Time (min)0.511.52Counts5x1000.511.522.533.541.146 min.Acquisition Time (min)0.511.52Relative Abundance (%)2x1000.20.40.60.81306.0 -> 140.0 , 306.0 -> 122.0Ratio = 44.5 (100.7 %)山莨菪碱+ MRM (304.0 -> 138.0) STD5.dAcquisition Time (min)0.511.52Counts5x1001234561.275 min.Acquisition Time (min)0.511.52Relative Abundance (%)2x1000.20.40.60.81304.0 -> 138.0 , 304.0 -> 156.0Ratio = 87.1 (101.1 %)东莨菪碱7+ MRM (290.0 -> 124.0) STD5.dAcquisition Time (min)11.52Counts5x100123456781.427 min.Acquisition Time (min)11.52Relative Abundance (%)2x1000.20.40.60.81290.0 -> 124.0 , 290.0 -> 93.0Ratio = 33.1 (100.8 %)阿托品+ MRM (235.0 -> 86.0) STD5.dAcquisition Time (min)0.511.522.53Counts6x1000.250.50.7511.251.51.751.479 min.Acquisition Time (min)0.511.522.53Relative Abundance (%)2x1000.20.40.60.81235.0 -> 86.0 , 235.0 -> 58.1Ratio = 13.5 (99.5 %)利多卡因图 B 标准品多反应监测（MRM）色谱图本方法负责起草单位：中国食品药品检定研究院 本方法的参与验证单位：中国肉类食品综合研究中心、黑龙江食品药品检验检测所、江苏省 食品药品监督检验研究院、大连市食品检验所、辽宁省食品检验检测院 主要起草人：王海燕、郭文萍、姜连阁、颜春荣、胡侠、高广彗