SDS蛋白电泳相关试剂配方.docx

凹凸分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol. - 2 -1 试验材料. - 2 -1.1 标本采集. - 2 -1.2 主要试剂：. - 2 -1.3 主要仪器设备及软件：. - 3 -2 试验方法. - 3 -2.1 标本采集. - 3 -2.2 主要溶液配制. - 3 -2.3 蛋白质样品制备. - 7 -2.4Bradford 法蛋白质定量 . - 8 -2.5SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 . - 9 -2.6 等浓度混合低分化腺癌组Pp高分化腺癌组Wp . - 10 -2.7 双向凝胶电泳IEF+SDS-. - 10 -2.7.1 第一向是等电聚焦电泳isoclectric focusing，IEF. - 10 - 2.7.2 其次向SDS- 电泳. - 11 - 2.8 图像分析. - 13 - 2.9 差异蛋白点的切取. - 13 - 1 -凹凸分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol1 试验材料1.1 标本采集3 例人高分化胃腺癌及 3 例人低分化胃腺癌组织取自兰大一院胃癌手术切除标本2009 年 4 月-10 月，并经病理检查确诊WHO 分型，所取组织没有出血和坏死。临床资料及存储见表一。表一：6 例胃癌标本病例资料序号编号住院号姓名性别年龄取材时间癌灶位置组织分型TNM分期临床分期存放1张建442007张建男77090408胃窦低分T2bIIIa液 氮功功 A化N2M0转 移-802朱怀443253朱怀男61090420胃体低分T2bIIIa液 氮仪仪 A化N2M0转 移-803闫茂444423闫茂男60090430胃体低分T2bIIIa液 氮金金 A化N2M0转 移-804柯玉446003柯玉女42090521胃体高分T2bIb液 氮花花 A化N0 M0转 移-805任永怀4600101020A男61091020胃窦高分化T2bN1II-40M06王杭461295011027男34091027胃窦高中T2aIb液 氮杭王分化N02周M0转 移至-801.2 主要试剂：超纯尿素urea, 十二烷基磺酸钠(SDS)，丙烯酰胺(acrylamide)，甲叉-双丙烯酰胺(, -methylenebisacrylamide)，pH 3-10 固相化非线性 17 cm 干胶条(IPG strip), IPG 缓冲液PH3-10NL，17cm、两性电解质Bio-Lyte,pH3-10、甘氨酸(glycine)、Tris 碱、CHAPS(两性离子去垢剂)购自美国 Bio-Rid 公司；硫脲sulfocarbamide均购自 sigma 公司；蛋白酶抑制剂complete EDTA free 购自美国罗氏公司；过硫酸铵(APS)，二硫苏糖醇(DTT),碘乙酰胺(indoacetamide),，均购自上海生工。考马斯亮蓝G-250 购自鹏程分装Amersco、四甲基乙二胺(TEMED)购自鹏程 Sigma 分装,小牛血清蛋白BSA购自北京索莱宝封装 Roche。甘油、甲醇、乙醇、冰乙酸、盐酸、磷酸等均购自国产分析纯试剂。1.3 主要仪器设备及软件：Bio-Rad proteinIEFcell 型等电聚焦仪Bio-Rad 公司产品 Bio-Rad proteinXI cell 型垂直电泳槽Bio-Rad 公司产品 PDQuest 7.0 软件Bio-Rad 公司产品低温循环水浴箱 凝胶成像系统台式低温高速离心机水平脱色摇床电子周密天平国产 液氮罐超低温冰箱-80Thermo 公司产品超声裂开仪酶标仪去离子水系统 高温高压消毒锅电热恒温鼓风枯燥箱磁力搅拌器PH 测定仪去离子水系统可调式微量移液器：1000ul、200ul、20ul、2.5ul 规格各两支2 试验方法2.1 标本采集3 例人高分化胃腺癌及 3 例人低分化胃腺癌组织取自兰大一院胃癌手术切除标本。胃癌手术中取下肿瘤组织后，切取约2g(2×2×3cm3)大小的胃癌组织，所取组织剔除结缔组织，于冰 盐水或预冷的PBS 液清洗干净，滤纸吸去多余液体，分切成5 份装入 2mL 冻存管内，标记后马上放入液氮罐内，此过程在组织离体30 分钟内完成。试验前转移至-80冰箱备用。记 录患者姓名、性别、年龄、住院号、取材时间、癌灶位置、组织分型、TNM 分期、临床分期。2.2 主要溶液配制PBS 缓冲液试剂含量- 3 -NaCl KClNa HPO24KH PO24超纯水8.0g0.2g1.440.27定容至 1000mlHCl 调PH 至 7.4，高压消毒，室温保存。Ø 蛋白酶抑制剂Complete EDTA-free 分装：25×cocktail：试剂cocktail 去离子水-20保存含量1 片泡 50ml 2mlØ 10ml 蛋白质裂解液lysis buffer试剂浓度含量尿素8M4.8048g硫脲2M1.522gCHAPS4%0.400gTris超纯水40mM0.0485g定容至 10ml溶解混匀后每EP 管分装 1ml, -20保存,使用时不行反复冻融，用时每 1ml 分装管中现加:试剂浓度含量25×cocktail4%40ulDTT65mM0.01gBioLyte2%5ul(0.2%)Ø Bradford 染色液储藏液 试剂95%乙醇88%磷酸考马斯亮蓝G250 4避光保存，使用前滤纸过滤Ø Bradford 染色液工作液 试剂Bradford 储藏液超纯水滤纸过滤后避光室温保存含量50ml 100ml 100mg含量30ml定容至 200mlØ 牛血清白蛋白BSA储存液1mg/ml试剂含量牛血清白蛋白超纯水溶解混匀后每EP 管分装 1ml,- 20保存。Ø 30%聚丙烯酰胺贮液试剂丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺超纯水滤纸过滤后，棕色瓶 4冰箱保存Ø 1.5mol/L Tris碱 pH8.8试剂Tris 碱超纯水10mg定容至 10ml含量150g4g 500ml含量90.75g400ml- 10 -用 1mol/L HCl 调 pH 至 8.8，加 MilliQ 水定容至 500ml。4冰箱保存。Ø 1M Tris-HCl pH6.8试剂Tris 碱超纯水含量121.1g800ml用 1mol/L HCl 调 pH 至 6.8，加 MilliQ 水定容至 1000ml。4冰箱保存。Ø 0.5mol/L Tris碱 pH6.8试剂Tris 碱超纯水含量12g 120ml用 1mol/L HCl 调 pH 至 6.8，加 MilliQ 水定容至 200ml。4冰箱保存。Ø 10% SDS试剂SDS超纯水混匀后，室温保存。Ø 10% Ap试剂过硫酸铵APS 超纯水溶解后，4冰箱保存。含量10g 100ml含量0.1g1mlØ 10×电泳缓冲液1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3试剂含量Tris 碱甘氨酸30g144gSDS10g超纯水1L混匀后，室温保存。Ø 1%溴酚蓝试剂含量溴酚蓝0.01g超纯水1ml避光室温保存Ø 2×SDS- 上样缓冲液试剂含量0.5M pH6.8 Tris 碱10% SDS2.0ml4.0ml甘油2.0ml1% 溴酚蓝0.05ml超纯水DTT定容至 10ml 0.154g(用时现加)Ø 水化上样缓冲液试剂浓度含量尿素7M4.0g硫脲2M1.52gCHAPS4%0.4g超纯水定容至 10ml溶解混匀后每EP 管分装 1ml, -20保存,使用时不行反复冻融，用时每 1ml 分装管中现加:试剂浓度含量DTT65mM0.01Bio-Lyte0.2%(w/v)5l 40%溴酚蓝0.001%1ul(1%溴酚蓝)Ø 胶条平衡缓冲液母液试剂浓度含量尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375M pH8.825ml1.5M pH8.8 Tris-HCl甘油20%20ml超纯水定容至 100ml分装成 10 管，每管 10ml，-20冰箱保存Ø 胶条平衡缓冲液I试剂胶条平衡缓冲液母液含量10mlDTT0.2g充分混匀，用时现配。Ø 胶条平衡缓冲液II试剂含量胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g充分混匀，用时现配Ø 低熔点琼脂糖封胶液试剂浓度含量低熔点琼脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml10% SDS溴酚蓝0.001%100l 1%溴酚蓝超纯水定容至 100ml加热溶解至澄清，室温保存Ø 考马斯亮蓝G250 染色液试剂浓度含量Coomassie Blue G-2500.1% (w/v)1.0 g甲醇40% (v/v)400 ml冰醋酸10% (v/v)100 ml超纯水定容至 1000ml避光室温保存Ø 考马斯亮蓝染色脱色液试剂浓度含量甲醇40% (v/v)400 ml冰醋酸10% (v/v)100 ml超纯水定容至 1000ml室温保存2.3 蛋白质样品制备试验用品：眼科剪、镊子、组织匀浆器、一次性塑料小研磨棒、1.5mlEP 管、冰盒、冰袋、玻璃培育皿、电子天平、超声裂开仪、超速低温离心机、水平摇床、可调式微量移液器：1000ul、 200ul、20ul、2.5ul 规格各两支试验试剂：尿素、硫脲、CHAPS、Tris、超纯水、蛋白酶抑制剂Complete EDTA-free、DTT、Bio-Lyte试验标本：低分化腺癌组poorly3 例：以住院号后四位标记 2007、3253、4423，高分化腺癌组well3 例：以住院号后四位标记：6003、0010、1295Ø 将干净的眼科剪、镊子、组织匀浆器、一次性塑料小研磨棒、1.5mlEP 管、冰盒、冰袋、玻璃培育皿-20冰箱预冷。Ø 从-80取出 2007 号标本，室温下解冻，冰盒上放置玻璃培育皿眼科剪剪取米粒大小，称取约 100mg 组织，放置在冰浴状态下的EP 管中，参加 500ul 蛋白质裂解液，眼科剪快速将组织剪成肉糜状，再用一次性塑料小研磨棒快速充分研磨 1min，直至管内物质变成组织悬浊液。Ø 应用超声细胞裂开仪在冰浴下进展细胞裂开，运行120S80w,超声 1s,间隙 3s，30 个循环。尽可能少产生泡沫，4保存。Ø 裂解完毕后，4下，18000rpm,离心 40min。Ø 用微量移液器留神吸取上清注入EP 管中，混匀后，50ul 分装，-80冻存备用。其他 5 例样本 3253、4423、6003、0010、1295 依次依据上述步骤提取蛋白，留意提取每例样本时要用 75%酒精将培育皿，眼科剪、镊子等接触样本的器械擦洗干净。用超纯水清洗超声探头，滤纸擦拭干净。2.4 Bradford 法蛋白质定量试验用品：12 各清洁的EP 管、12 支清洁的 15ml 离心管、离心管架、96 孔板，可调式微量移液器：1000ul、200ul 各一支、电子天平试验试剂：牛血清白蛋白BSA储存液1mg/ml、Bradford 染色液工作液、超纯水试验标本：50ul 分装的 2007、3253、4423、6003、0010、1295 六例标本各一管Ø 在 12 支 EP 管上和 12 支离心管上标记：1、2、3、4、5、6、2007、3253、4423、6003、0010、1295，各管按下表所示依次参加各试剂序号BSAul超纯水(ul)混匀取出量(ul)Bradford染色工作液(ml)浓度(mg/ml)10100010050220080010050.2340060010050.4460040010050.6580020010050.86100001005120075951005325359510054423595100600359510050010595100512955951005Ø 稍微摇匀参加 Bradford 染色工作液的离心管，静置约 20min 后，各管吸取吸 3 次，每次吸取 200ul 纵行排列参加到 96 孔板中的 3 个孔中。Ø 将加好蛋白样品的 96 孔放入酶标仪中，读取OD595的吸光值。计算每管的平均值。Ø 在 EXCEL 中以标准管的蛋白量为Y 轴，吸光值为Y 绘制标准曲线。2.5 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳试验用品：“六一”大槽电泳仪、100ml 烧杯 3 个、水平摇床、电子天平、可调式微量移液器：5ml、1000ul、200ul、20ul、2.5ul 规格各两支、EP 管假设干、水浴锅、染色盘、脱色盘、长针头、滤纸试验试剂：30%聚丙烯酰胺贮液、1.5mol/L Tris碱 pH8.8、1mol/L Tris碱 pH6.8、10%SDS、10% Ap、TEMED、10×电泳缓冲液、1%溴酚蓝、2×SDS- 上样缓冲液、考马斯亮蓝G250 染色液、考马斯亮蓝染色脱色液试验样品：2007、3253、4423、6003、0010、1295 蛋白各 300g、Mark100ulØ 温水浴溶解结晶的 10%SDS；洗净晾干电泳槽、玻璃板干净透光不挂水珠、安装固定电泳装置，用 5ml 移液器参加 20ml 水，观看是否漏水，假设装置严密不漏水，将水倒尽，开头配胶。Ø 配制 12%分别胶试剂 超纯水30%聚丙烯酰胺贮液1.5M Tris(pH 8.8)10%SDS10%AP TEMED含量80ml26.432200.80.8(现加)0.032现加Ø灌分别胶：混匀分别胶后，每侧玻璃板中灌 40ml，用 5ml 移液器沿玻璃板一侧缓缓参加，避开气泡产生假设有气泡可用长针头挑去。Ø封胶：用正丁醇或异丙醇、或超纯水水封胶，用 5ml 移液器沿玻璃板一侧缓缓加入，加满。Ø聚合：静置40min-60min(可过夜)。待分别胶凝固后，将正丁醇或异丙醇、或超纯水 倒尽，用超纯水清洗胶顶部数次，滤纸吸净水。Ø配制 5%积层胶试剂 超纯水30%聚丙烯酰胺贮液1M Tris(pH6 .8) 10%SDS含量20ml13.63.42.50.210%AP TEMED0.2(现加)0.02现加Ø 灌积层胶：混匀分别胶后，每侧玻璃板中灌 10ml，用 5ml 移液器沿玻璃板一侧缓缓参加，灌满，避开气泡产生假设有气泡可用长针头挑去。插入梳子。Ø 聚合：室温静置聚合 30min。Ø 变性：从-80冰箱中取出 2007、3253、4423、6003、0010、1295 蛋白样品各 300g， 等体积 1：1 参加样品及 2×SDS 上样缓冲液或 4：1 参加样品及 5×SDS 上样缓冲液，将加好上样缓冲液的蛋白样品及Mark 沸水浴煮 3min 变性插入冰浴冷却后加样。Ø 拔梳子，超纯水清洗加样空，用针头拨正加样空。Ø 将 10×电泳缓冲液稀释成 1×电泳缓冲液，加满电泳槽内槽，外槽加至槽的1/5。Ø 加样：将 2007、3253、4423、Mark、6003、0010、1295 自左向右参加加样空，其余孔参加等体积的上样缓冲液。Ø 检查一下电路连通状况留意正负及，接通电源，以电压为标准：起始时用低电压80V，待样品在浓缩胶局部浓缩成一条线后(约 30min)，再加大电压(350v)，待溴酚蓝指示剂到达底部边缘时即可停顿电泳。以电流为标准，开头进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶局部浓缩成一条线后，再加大电流到25mA/gel。Ø 电泳完毕后，轻轻撬开两层玻璃，在左上角切角以作记号，取出凝胶将玻璃板斜立在盛有超纯水的染色盘中，用铲胶器撬起一小块凝胶浸入水中，靠水的张力缓慢取出凝胶， 防止凝胶裂开，戴手套，防止污染胶面。Ø 染色：参加足量的考马斯亮蓝G-250 染液，于水平摇床上染色 60 分钟。染色完毕后弃去染色液。Ø 脱色：参加脱色液，在水平摇床上脱色，直至背景脱净为止留意观看，防止脱色过渡或不全。Ø 保存：可用 10%的冰醋酸保存。Ø 成像：凝胶成像系统成像并保存图像tif、jpg 两种格式。2.6 等浓度混合低分化腺癌组Pp高分化腺癌组WpØ 低分化腺癌组poorly3 例： 2007、3253、4423，以蛋白浓度最低的样本为标准，用蛋白质裂解液稀释其余两管，使 3 管样本蛋白浓度全都，等体积混合 800ug，以 Pp(poorly pooling)表示。Ø 高分化腺癌组well3 例：6003、0010、1295，按上述方法等体积混合 800ug,以Wp(wellpooling)表示。2.7 双向凝胶电泳IEF+SDS-2.7.1 第一向等电聚焦电泳isoclectric focusing，IEF试验用品：Bio-Rad proteinIEFcell 型等电聚焦仪、聚焦盘、水化盘、镊子、可调式微量移液器： 1000ul、200ul、规格各一支、电子天平、EP 管试验试剂：水化上样缓冲液、DTT、Bio-Lyte、IPG 预制胶条pH3-10,17cm、矿物油试验样品：Pp 组 800ug ；Wp 组 800ugØ 洗净、晾干聚焦盘或水化盘。Ø 从冰箱中取-20冷冻保存的水化上样缓冲液不含DTT，不含Bio-Lyte一小管1ml/管，置室温溶解。Ø 在小管中参加0.01g DTT， Bio-Lyte 5l40%，充分混匀。Ø 从小管中取出水化上样缓冲液，参加800g样品、并参加1.75ul IPG Buffer,共350ul充分混匀。Ø 从冰箱取-20冷冻保存的IPG预制胶条17cm pH 3-10，于室温放置10分钟.Ø 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性参加样品。在槽两端各 1cm左右不要加样，中间的样品液肯定要连贯。留意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。Ø 当全部的蛋白质样品都已经参加到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。Ø 分清胶条的正负极，轻轻地将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极标有+对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极严密接触。不要使样品溶液弄到胶条反面的塑料支撑膜上，由于这些溶液不会被胶条吸取。同样还要留意不使胶条下面的溶液产生气泡。假设已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。Ø 在每根胶条上掩盖 2-3ml 矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的参加矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴渐渐加在塑料支撑膜上。Ø 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。Ø 等电聚焦程序设置17cm胶条水化50V12-16小时20主动水化S1250V线性30min除盐S21000V快速1h除盐S310000V线性5h升压S410000V快速60,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持选择所放置的胶条数。设置每根胶条的极限电流。20A/根留意：17cm胶条的极限电流不超过50A/根，最好也在30A/根以下设置等电聚焦时的温度。20Ø 聚焦完毕的胶条。马上进展平衡、其次向SDS-电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-80冰箱保存。2.7.2 其次向 SDS- 电泳试验用品：Bio-Rad proteinXI cell 型垂直电泳槽、低温循环水浴箱、溶胀盘、镊子、100ml 烧杯 3 个、水平摇床、电子天平、可调式微量移液器：5ml、1000ul、200ul、20ul、2.5ul 规格各一支、EP 管假设干、水浴锅、染色盘、脱色盘、长针头，滤纸试验试剂：试验试剂：30%聚丙烯酰胺贮液、1.5mol/L Tris 碱 pH8.8、10%SDS、10% Ap、TEMED、胶条平衡缓冲液母液、DTT、碘乙酰胺、低熔点琼脂糖封胶液、10×电泳缓冲液、考马斯亮蓝G250 染色液、考马斯亮蓝染色脱色液试验样品：第一向等电聚焦好的Pp 组胶条；Wp 组胶条Ø 温水浴溶解结晶的 10%SDS；洗净晾干制胶器、溶胀盘、玻璃板干净透光不挂水珠、安装固定电泳装置，用 5ml 移液器参加 20ml 水，观看是否漏水，假设装置严密不漏水， 将水倒尽，开头配胶。Ø 配制 12%的丙烯酰胺凝胶两块。配 80ml 凝胶溶液，每块凝胶 40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留 1cm 的空间，用超纯水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平坦。聚合 30 分钟。一般凝胶与上方液体分层后，说明凝胶已根本聚合。试剂 超纯水30%聚丙烯酰胺贮液1.5M Tris(pH 8.8)10%SDS10%AP TEMED含量80ml26.432200.80.8(现加)0.032现加Ø 待凝胶凝固后，倒去分别胶外表的超纯水、乙醇或水饱和正丁醇，用超纯水冲洗。Ø 从-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置10 分钟，使其溶解。Ø 配制胶条平衡缓冲液I。Ø 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用超纯水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以削减凝胶染色时消灭的纵条纹。Ø 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中参加 5ml 胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇摆15 分钟。Ø 配制胶条平衡缓冲液II。Ø 第一次平衡完毕后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶外表。再参加胶条平衡缓冲液II，连续在水平摇床上缓慢摇摆 15 分钟。Ø 用滤纸吸去 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的其次向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。Ø 将琼脂糖封胶液进展加热溶解。Ø 将 10×电泳缓冲液，用量筒稀释 10 倍，成 1×电泳缓冲液。赶去缓冲液外表的气泡。Ø 其次次平衡完毕后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶外表。Ø 将 IPG 胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。Ø 将放有胶条的 SDS- 凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方参加低熔点琼脂糖封胶液。Ø 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。留意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时， 要留意是推动凝胶反面的支撑膜，不要遇到胶面。Ø 放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。Ø 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。Ø 检查一下电路连通状况留意正负及，接通电源，以电压为标准：起始时用低电压80V，待样品在浓缩胶局部浓缩成一条线后(约 30min)，再加大电压(350v)，待溴酚蓝指示剂到达底部边缘时即可停顿电泳。以电流为标准，开头进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶局部浓缩成一条线后，再加大电流到25mA/gel。Ø 电泳完毕后，轻轻撬开两层玻璃，在左上角用 200ul 枪头打孔以作记号Pp 组打 1 个孔，Wp 打 2 个孔，取出凝胶将玻璃板斜立在盛有超纯水的染色盘中，用铲胶器撬起一小块凝胶浸入水中，靠水的张力缓慢取出凝胶，防止凝胶裂开，戴手套，防止污染胶面。Ø 染色：参加足量的考马斯亮蓝G-250 染液，于摇床上染色 60 分钟。染色完毕后弃去染色液。Ø 脱色：参加脱色液，在摇床上脱色，直至背景脱净为止留意观看，防止脱色过渡或不全。Ø 保存：可用 10%的冰醋酸保存。Ø 成像：凝胶成像系统成像并保存图像tif、jpg 两种格式。2.8 图像分析凝胶经成像后经Pdquest 图形分析软件对 2-DE 图谱进展了分析Ø 通过蛋白点自动检测(spot detection)和手工标记取点获得蛋白质点检测图;Ø 利用背景扣除(background deduction)消减局部背景条纹;Ø 进展第一向等电点校正(correction)和其次向分子量校正;Ø 选取一张凝胶图作为参考凝胶(refrence gel),其余图谱与之进展配比,生成凝胶分析报告, 并进展手工修正.从凝胶分析报告中可以获得蛋白点的等电点 ,分子量,蛋白质表达量及凝胶之间的点匹配率等信息.。2.9 差异蛋白点的切取Ø 结合软件分析和手工筛选，从有或无和表达差异蛋白质点中的选取假设干个清楚且表达水平转变明显的蛋白质点作为最终质谱鉴定的对象。Ø 将 200ul 的枪头按蛋白点的大小剪掉枪头尖，垂直对准差异点切取，放入干净的EP 管中，标记好，4冰箱保存。尽快送公司鉴定。Ø 其余胶放入干净的保鲜袋 4冰箱保存。Ø 将保存差异蛋白点的EP 管封口膜分好，装在封口袋中，放在装有冰袋的保温盒中尽快寄送往上海博苑质谱鉴定公司鉴定。