SDS蛋白电泳相关试剂配方.docx
《SDS蛋白电泳相关试剂配方.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《SDS蛋白电泳相关试剂配方.docx(14页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、凹凸分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol. - 2 -1 试验材料. - 2 -1.1 标本采集. - 2 -1.2 主要试剂:. - 2 -1.3 主要仪器设备及软件:. - 3 -2 试验方法. - 3 -2.1 标本采集. - 3 -2.2 主要溶液配制. - 3 -2.3 蛋白质样品制备. - 7 -2.4Bradford 法蛋白质定量 . - 8 -2.5SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 . - 9 -2.6 等浓度混合低分化腺癌组Pp高分化腺癌组Wp . - 10 -2.7 双向凝胶电泳IEF+SDS-. - 10 -2.7.1 第一向是等电聚焦电泳isoclectric f
2、ocusing,IEF. - 10 - 2.7.2 其次向SDS- 电泳. - 11 - 2.8 图像分析. - 13 - 2.9 差异蛋白点的切取. - 13 - 1 -凹凸分化胃癌组织的双向凝胶电泳分析Protocol1 试验材料1.1 标本采集3 例人高分化胃腺癌及 3 例人低分化胃腺癌组织取自兰大一院胃癌手术切除标本2009 年 4 月-10 月,并经病理检查确诊WHO 分型,所取组织没有出血和坏死。临床资料及存储见表一。表一:6 例胃癌标本病例资料序号编号住院号姓名性别年龄取材时间癌灶位置组织分型TNM分期临床分期存放1张建442007张建男77090408胃窦低分T2bIIIa液
3、氮功功 A化N2M0转 移-802朱怀443253朱怀男61090420胃体低分T2bIIIa液 氮仪仪 A化N2M0转 移-803闫茂444423闫茂男60090430胃体低分T2bIIIa液 氮金金 A化N2M0转 移-804柯玉446003柯玉女42090521胃体高分T2bIb液 氮花花 A化N0 M0转 移-805任永怀4600101020A男61091020胃窦高分化T2bN1II-40M06王杭461295011027男34091027胃窦高中T2aIb液 氮杭王分化N02周M0转 移至-801.2 主要试剂:超纯尿素urea, 十二烷基磺酸钠(SDS),丙烯酰胺(acrylam
4、ide),甲叉-双丙烯酰胺(, -methylenebisacrylamide),pH 3-10 固相化非线性 17 cm 干胶条(IPG strip), IPG 缓冲液PH3-10NL,17cm、两性电解质Bio-Lyte,pH3-10、甘氨酸(glycine)、Tris 碱、CHAPS(两性离子去垢剂)购自美国 Bio-Rid 公司;硫脲sulfocarbamide均购自 sigma 公司;蛋白酶抑制剂complete EDTA free 购自美国罗氏公司;过硫酸铵(APS),二硫苏糖醇(DTT),碘乙酰胺(indoacetamide),,均购自上海生工。考马斯亮蓝G-250 购自鹏程分装
5、Amersco、四甲基乙二胺(TEMED)购自鹏程 Sigma 分装,小牛血清蛋白BSA购自北京索莱宝封装 Roche。甘油、甲醇、乙醇、冰乙酸、盐酸、磷酸等均购自国产分析纯试剂。1.3 主要仪器设备及软件:Bio-Rad proteinIEFcell 型等电聚焦仪Bio-Rad 公司产品 Bio-Rad proteinXI cell 型垂直电泳槽Bio-Rad 公司产品 PDQuest 7.0 软件Bio-Rad 公司产品低温循环水浴箱 凝胶成像系统台式低温高速离心机水平脱色摇床电子周密天平国产 液氮罐超低温冰箱-80Thermo 公司产品超声裂开仪酶标仪去离子水系统 高温高压消毒锅电热恒温
6、鼓风枯燥箱磁力搅拌器PH 测定仪去离子水系统可调式微量移液器:1000ul、200ul、20ul、2.5ul 规格各两支2 试验方法2.1 标本采集3 例人高分化胃腺癌及 3 例人低分化胃腺癌组织取自兰大一院胃癌手术切除标本。胃癌手术中取下肿瘤组织后,切取约2g(223cm3)大小的胃癌组织,所取组织剔除结缔组织,于冰 盐水或预冷的PBS 液清洗干净,滤纸吸去多余液体,分切成5 份装入 2mL 冻存管内,标记后马上放入液氮罐内,此过程在组织离体30 分钟内完成。试验前转移至-80冰箱备用。记 录患者姓名、性别、年龄、住院号、取材时间、癌灶位置、组织分型、TNM 分期、临床分期。2.2 主要溶液
7、配制PBS 缓冲液试剂含量- 3 -NaCl KClNa HPO24KH PO24超纯水8.0g0.2g1.440.27定容至 1000mlHCl 调PH 至 7.4,高压消毒,室温保存。 蛋白酶抑制剂Complete EDTA-free 分装:25cocktail:试剂cocktail 去离子水-20保存含量1 片泡 50ml 2ml 10ml 蛋白质裂解液lysis buffer试剂浓度含量尿素8M4.8048g硫脲2M1.522gCHAPS4%0.400gTris超纯水40mM0.0485g定容至 10ml溶解混匀后每EP 管分装 1ml, -20保存,使用时不行反复冻融,用时每 1ml
8、 分装管中现加:试剂浓度含量25cocktail4%40ulDTT65mM0.01gBioLyte2%5ul(0.2%) Bradford 染色液储藏液 试剂95%乙醇88%磷酸考马斯亮蓝G250 4避光保存,使用前滤纸过滤 Bradford 染色液工作液 试剂Bradford 储藏液超纯水滤纸过滤后避光室温保存含量50ml 100ml 100mg含量30ml定容至 200ml 牛血清白蛋白BSA储存液1mg/ml试剂含量牛血清白蛋白超纯水溶解混匀后每EP 管分装 1ml,- 20保存。 30%聚丙烯酰胺贮液试剂丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺超纯水滤纸过滤后,棕色瓶 4冰箱保存 1.5mol/L Tr
9、is碱 pH8.8试剂Tris 碱超纯水10mg定容至 10ml含量150g4g 500ml含量90.75g400ml- 10 -用 1mol/L HCl 调 pH 至 8.8,加 MilliQ 水定容至 500ml。4冰箱保存。 1M Tris-HCl pH6.8试剂Tris 碱超纯水含量121.1g800ml用 1mol/L HCl 调 pH 至 6.8,加 MilliQ 水定容至 1000ml。4冰箱保存。 0.5mol/L Tris碱 pH6.8试剂Tris 碱超纯水含量12g 120ml用 1mol/L HCl 调 pH 至 6.8,加 MilliQ 水定容至 200ml。4冰箱保存
10、。 10% SDS试剂SDS超纯水混匀后,室温保存。 10% Ap试剂过硫酸铵APS 超纯水溶解后,4冰箱保存。含量10g 100ml含量0.1g1ml 10电泳缓冲液1= 25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3试剂含量Tris 碱甘氨酸30g144gSDS10g超纯水1L混匀后,室温保存。 1%溴酚蓝试剂含量溴酚蓝0.01g超纯水1ml避光室温保存 2SDS- 上样缓冲液试剂含量0.5M pH6.8 Tris 碱10% SDS2.0ml4.0ml甘油2.0ml1% 溴酚蓝0.05ml超纯水DTT定容至 10ml 0.154g(用时现加) 水化上样缓冲液试
11、剂浓度含量尿素7M4.0g硫脲2M1.52gCHAPS4%0.4g超纯水定容至 10ml溶解混匀后每EP 管分装 1ml, -20保存,使用时不行反复冻融,用时每 1ml 分装管中现加:试剂浓度含量DTT65mM0.01Bio-Lyte0.2%(w/v)5l 40%溴酚蓝0.001%1ul(1%溴酚蓝) 胶条平衡缓冲液母液试剂浓度含量尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375M pH8.825ml1.5M pH8.8 Tris-HCl甘油20%20ml超纯水定容至 100ml分装成 10 管,每管 10ml,-20冰箱保存 胶条平衡缓冲液I试剂胶条平衡缓冲液母液含量10mlDTT0
12、.2g充分混匀,用时现配。 胶条平衡缓冲液II试剂含量胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g充分混匀,用时现配 低熔点琼脂糖封胶液试剂浓度含量低熔点琼脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml10% SDS溴酚蓝0.001%100l 1%溴酚蓝超纯水定容至 100ml加热溶解至澄清,室温保存 考马斯亮蓝G250 染色液试剂浓度含量Coomassie Blue G-2500.1% (w/v)1.0 g甲醇40% (v/v)400 ml冰醋酸10% (v/v)100 ml超纯水定容至 1000ml避光室温保存 考马斯亮蓝染色脱色液试剂浓度含
13、量甲醇40% (v/v)400 ml冰醋酸10% (v/v)100 ml超纯水定容至 1000ml室温保存2.3 蛋白质样品制备试验用品:眼科剪、镊子、组织匀浆器、一次性塑料小研磨棒、1.5mlEP 管、冰盒、冰袋、玻璃培育皿、电子天平、超声裂开仪、超速低温离心机、水平摇床、可调式微量移液器:1000ul、 200ul、20ul、2.5ul 规格各两支试验试剂:尿素、硫脲、CHAPS、Tris、超纯水、蛋白酶抑制剂Complete EDTA-free、DTT、Bio-Lyte试验标本:低分化腺癌组poorly3 例:以住院号后四位标记 2007、3253、4423,高分化腺癌组well3 例:
14、以住院号后四位标记:6003、0010、1295 将干净的眼科剪、镊子、组织匀浆器、一次性塑料小研磨棒、1.5mlEP 管、冰盒、冰袋、玻璃培育皿-20冰箱预冷。 从-80取出 2007 号标本,室温下解冻,冰盒上放置玻璃培育皿眼科剪剪取米粒大小,称取约 100mg 组织,放置在冰浴状态下的EP 管中,参加 500ul 蛋白质裂解液,眼科剪快速将组织剪成肉糜状,再用一次性塑料小研磨棒快速充分研磨 1min,直至管内物质变成组织悬浊液。 应用超声细胞裂开仪在冰浴下进展细胞裂开,运行120S80w,超声 1s,间隙 3s,30 个循环。尽可能少产生泡沫,4保存。 裂解完毕后,4下,18000rpm
15、,离心 40min。 用微量移液器留神吸取上清注入EP 管中,混匀后,50ul 分装,-80冻存备用。其他 5 例样本 3253、4423、6003、0010、1295 依次依据上述步骤提取蛋白,留意提取每例样本时要用 75%酒精将培育皿,眼科剪、镊子等接触样本的器械擦洗干净。用超纯水清洗超声探头,滤纸擦拭干净。2.4 Bradford 法蛋白质定量试验用品:12 各清洁的EP 管、12 支清洁的 15ml 离心管、离心管架、96 孔板,可调式微量移液器:1000ul、200ul 各一支、电子天平试验试剂:牛血清白蛋白BSA储存液1mg/ml、Bradford 染色液工作液、超纯水试验标本:5
16、0ul 分装的 2007、3253、4423、6003、0010、1295 六例标本各一管 在 12 支 EP 管上和 12 支离心管上标记:1、2、3、4、5、6、2007、3253、4423、6003、0010、1295,各管按下表所示依次参加各试剂序号BSAul超纯水(ul)混匀取出量(ul)Bradford染色工作液(ml)浓度(mg/ml)10100010050220080010050.2340060010050.4460040010050.6580020010050.8610000100512007595100532535951005442359510060035951005001
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- SDS 蛋白 电泳 相关 试剂 配方
限制150内