Westernblot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程.docx
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1、Western blot 试验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2023 年 6 月第一局部细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程 (碧云天试剂盒)一、原理在争论细胞时常常要争论细胞的不同组份,而争论得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分别细胞核蛋白和细胞浆蛋白,不仅可以用于争论蛋白在细胞内的定位,而且很多时候分别出来的核蛋白可以用于转录调控方面的争论,例如EMSA(也称 gel shift),footprinting 等。细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)供给了一种比较简洁、便利
2、的从培育细胞或颖组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约 90 分钟就可以完成培育细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分别。抽提得到的蛋白可以用于 Western,EMSA,footprinting,报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂 A 和 B,在低渗透压条件下,使细胞充分膨胀,然后破坏细胞膜,释放出细胞浆蛋白,然后通过离心得到细胞核沉淀。最终通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提 50 个样品,假设每个样品的数量为约二百万细胞或约 30-50 毫克组织。二、留意事项1. 需自备 PMSF。PMSF 确定要在抽提试剂参与到样品中前 2
3、-3 分钟内参与,以免 PMSF 在水溶液中很快失效。2. 抽提蛋白的全部步骤都需在冰上或 4进展。3. 本试剂盒对于组织样品,仅适合于颖组织,对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常缺乏 100 个。4. 使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的 BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用 Bradford 法测定蛋白浓度。5. 为了您的安全和安康,请穿试验服并戴一次性手套操作。三、使用说明1. 预备溶液:室温融解试剂盒中的三种试剂,溶解后马上放置在冰上,混匀。取适当量的
4、细胞浆蛋白抽提试剂 A 备用,在使用前数分钟内参与PMSF,使PMSF 的最终浓度为 1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用,在使用前数分钟内参与 PMSF,使 PMSF 的最终浓度为 1mM。蛋白酶抑制剂可酌情翻倍2. 对于贴壁细胞:用 PBS 洗一遍,用细胞刮子刮下细胞,或用 EDTA 溶液0.5%处理 5min处理细胞使细胞不再贴壁很紧,并用移液器吹打下细胞。离心1400 r/min 5min收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。尽量避开用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。3. 对于悬浮细胞:用 PBS 洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。4
5、. 每 20 微升细胞沉淀参与 200 微升添加了 PMSF 的细胞浆蛋白抽提试剂 A。(对于二百万 Hela 细胞,其细胞沉淀的体积大约为 20 微升或 40 毫克。)5. 最高速猛烈涡旋震荡 5 秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(假设细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长震荡时间。)时间可稍长,保证细胞裂开6. 冰浴 10-15 分钟。7. 参与细胞浆蛋白抽提试剂 B 10 微升。最高速猛烈 Vortex 5 秒,冰浴 1 分钟。8. 最高速猛烈 Vortex 5 秒,4 12,000-16,000g 离心 5 分钟。9. 马上吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以
6、马上使用,也可以冻存。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保存微小体积的上清, 以免触及沉淀。)10. 对于沉淀,完全吸尽剩余的上清,参与 50 微升添加了 PMSF 的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)11. 最高速猛烈 Vortex 15-30 秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔 1-2 分钟再高速猛烈 Vortex 15-30 秒,共 30 分钟。12. 4 12,000-16,000g 离心 10 分钟。13. 马上吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白。可以马上使用,也可以-70冻存。14. 对于颖组织:A. 把组织尽可能切成格外
7、细小的碎片。依据 20:1 的比例混适宜当量的细胞浆蛋白抽提试剂 A 和 B(例如 200 微升细胞浆蛋白抽提试剂 A 中参与 10 微升抽提试剂 B)。并参与PMSF 至最终浓度为 1mM 配制成组织匀浆液。依据每 60mg 组织参与 200 微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液,并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或 4进展。B. 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内,冰浴放置 15 分钟。C. 4 1,500g 离心 5 分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中,为抽提得到的局部细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)D. 对于沉淀,到了这一步已经充分匀浆,但很多细胞还没有裂开。接下去依据
8、使用说明的步骤 4 开头操作,即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作,依据步骤 4 至步骤 13 抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤 14C 中抽提得到的细胞浆蛋白合并。其次局部蛋白定量-BCA 法(南京建成试剂盒)一、试验仪器:试管、微量移液器、旋涡混匀器、37水浴箱气浴箱、可见分光光度计562nm 二、适用范围:本试剂盒可测各种动物血清浆、组织、培育细胞、细胞培育上清及植物等样本中的蛋白含量。三、试剂组成及配制试剂一:粉剂 2 支、稀释液 12.5 ml 2 瓶试剂一应用液的配制:取试剂一粉剂 1 支与试剂一稀释液 1 瓶混匀,溶解完全后4 度待用。试剂二:2
9、50l 2 支工作液的配制:按试剂一应用液:试剂二=50:1 的比例配制,混匀后待用,用多少配多少。试剂三:终止剂贮存液 20ml 1 瓶终止剂应用液:取终止剂贮存液用双蒸水 5 倍稀释后备用,4 度冷藏试剂四:563 ug/ml 蛋白标准液 0.2ml 1 支,4 度保存 1 个月可分装-20 冷冻 四、操作步骤:1、样本前处理:、动物组织样本:准确称取组织重量,按重量g:体积(ml)=1:9 的比例,参与 9 倍体积的生理盐水,冰水浴条件下机械匀浆,2500 转/分,离心 10 分钟, 取上清液,待测。、植物组织样本:准确称取组织重量,按重量g:体积(ml)=1:9 的比例,参与 9 倍体
10、积的匀浆介质,冰水浴条件下机械匀浆,3500 转/分,离心 10 分钟, 取上清液,待测。、血清浆样本:按血清浆生理盐水=149 的比例稀释,待测。、其它液体样本:按比例稀释,测定范围为 202023g/ml,不同的样本稀释度不一样,请在批量测试前先做 12 个样本的预试验。2、操作表:空白管标准管测定管双蒸水l2000563g/ml 标准品l待测样本l00200020工作液l250250250漩涡混匀,37孵育30 分钟终止剂应用液l750750750漩涡混匀,静置 5 分钟,562nm 波长,水调零,0.5cm 光径测各管 OD 值五、计算公式:六、测定原理:碱性条件下,蛋白将 Cu2+复
11、原为 Cu+,Cu+与 BCA 试剂形成紫色的络合物,562nm处有最大吸取峰,依据吸光度与浓度成比例,通过测吸光度即可计算待测蛋白的浓度。七、检测范围检测浓度下限到达 20g/ml,最小检测蛋白量到达 0.5g,在 202023g/ml浓度范围内有良好的线性关系。标准曲线范围:标准品浓度g/ml02500确定 OD 值00.499第三局部Western blot 相关试剂配制A. 0%聚丙烯酰胺贮存液Acr/Bis:丙烯酰胺Acr,29g;N,N-亚甲基双丙烯酰胺Bis,1g,去离子水溶解,37水浴助溶,定容至 100mL。0.45m 滤器过滤,棕色瓶 4避光保存。B. 0%十二烷基硫酸钠S
12、DS:SDS,10g;H2O,80mL。68加热溶解,浓 HCl 调 pH 至 7.2,定容至 100mL,室温保存。C. 0%过硫酸铵AP:AP,1g;H2O,10mL。避光,4保存。42 周 D分别胶缓冲液1.5MTris-HCl pH8.8:Tris,18.17g;H2O 80mL。用浓 HCl调 pH 至 8.8,定容至 100mL,4保存。E浓缩胶缓冲液1.0MTris-HCl pH6.8:Tris,12.11g;H2O 80mL。用浓 HCl调 pH 至 6.8,定容至 100mL,4保存。F电泳缓冲液10:甘氨酸Glycine,188g;Tris 30.2g;SDS,10g;H2
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