硝酸还原酶测定方法(共3页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上硝酸还原酶活力的测定1原理硝酸还原酶( nitrate reductase,NR ),是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐(NO3+NADH+H NO2+NAD+H 2 O )。产生的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸(或对氨基苯磺酰胺)及- 萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下: 生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以ug/(gh) 为单位。NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单,适合快速、多组测定。离体法复杂,但重复性较好
2、。 药品配制1) 0.1mol/L pH为7.5的磷酸缓冲液: 称取Na2HPO412H2O 30.0905g, NaH2 PO42H2O 2.4965g, 溶解并定容至1000ml.2) 0.2 mol/L KNO3溶液: 2.5275g KNO3用pH为7.5的磷酸缓冲液溶解并定容至100 ml.3) 30%三氯乙酸:75.0g 三氯乙酸用水定容至250mL。4) 硝酸试剂的配制: 0.5g -萘胺加水煮沸1-2分钟,趁热加入1.25g 对氨基苯磺酸,再加250 ml冰醋酸,加水定容至500mL.保存于暗处.2酶活性测定1) 称样: 从田间取回新鲜叶片,用水洗净,吸干水份,用打孔器打出直径
3、 0.5cm 的叶圆片,用蒸馏水冲洗叶圆片 1 2 次,用吸水纸把水吸干后,称取等重叶圆片4份,每份重 0.5 g ,放入50mL的三角瓶中。2) 抽提: 正常处理向每个三角瓶中先后加入5mL磷酸缓冲液溶和5mL硝酸溶液;对照处理先加1mL三氯乙酸,再加其它两种溶液。在黑暗的条件下用真空泵反复抽提30分钟.3) 放置: 在黑暗,25条件下放置30分钟.4) 终止反应: 正常处理向三角瓶中加入1mL三氯乙酸;对照处理不加三氯乙酸。然后吸取反应液 2mL,然后各加8 mL硝酸试剂.30分钟后用分光光度计在 540 nm 波长下比色.3计算公式NR活性ug/(gh) B*11*10/(2*m*h) B:比色液中浓度ug/gh M:样品质量 g H:时间 (小时)硝酸还原酶活力的测定称4份,0.500g/份,放入50mL的三角瓶中,正常3份,对照1份。正常5ml磷酸缓冲液5ml硝酸钾溶液对照1ml三氯乙酸5ml磷酸缓冲液溶5ml硝酸钾溶液黑暗,真空泵抽提30分钟黑暗,25条件下放置30分钟向三角瓶中加入1mL三氯乙酸吸取反应液 2ml加8 ml硝酸试剂540 nm 波长下比色专心-专注-专业
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