RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南(共6页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂:氯仿,异丙醇,75乙醇,无RNase的水或0.5SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。操作步骤:1. 匀浆处理 a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.,大约100mg 叶片使用1 ml Trizol. b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%. c. 单层培养细胞.直接在培养板中
2、加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞,每5-10106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞,以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10min,10 000rpm 离心1min。弃上清,收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。2.
3、将匀浆样品在15-30放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离。3. 可选步骤:4 10 000rpm离心10min,取上清。如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等,可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂,应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s,室温放置3min。如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替。5. 4 10 000rpm离心10-15min,样品会分成三层:红色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相
4、中,把水相(约600ul,约为所用Trizol试剂的60%)转移到新管中。(如要分离蛋白质和DNA,可保留黄色的有机相)6. 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇,混匀,-20 放置20-30min。植物或动物组织RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染:在上清中加入1/2体积的异丙醇,1/2体积的RNA助沉剂,然后进行以下操作。7. 4 10 000rpm离心10min,去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。8. 加入1ml 75%乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至
5、少加1ml乙醇。9. 4 10 000rpm离心2min,弃上清;短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀。10. 室温放置晾干(不要晾得过干,RNA完全干燥后会很难溶解,大约晾干2-3min左右即可)。加入适量DEPC水(根据实验需要,可加30-100ul水)或0.5%SDS,用枪头吸打几次,充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100 的去离子甲酰胺溶解,-70保存。注意事项:1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) :加800ul Trizol,样品裂解后加氯仿,分层,沉淀RNA前,加5-10ug RNase-free
6、糖原,糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成,也不影响PCR反应。2. 匀浆后,加氯仿前,样品可在-70 放置一个月以上:RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8 一个星期或-20 一年以上。如果要长期保存,RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中,-70 长期保存。预防RNase污染,应注意以下几个方面:1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。2. 使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器
7、皿可在150 烘烤4h,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。4. 配制溶液应使用无RNase的水(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至中浓度0.1%(v/v),放置过夜,高压灭菌。注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作)。不同组织或细胞RNA提取预期得率植物叶片 100-200ug/g叶片动物组织 200-400ug/g肝脏组织动植物培养细胞 5-10ug/106细胞大肠杆菌 2-10ug/mlDH5过夜菌血液 3-5ug/ml人全血问题指南:低得率A. 样品裂解或匀浆处理不彻底B. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A2801.
8、65A. 检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下A280会较高。B. 样品匀浆时加的试剂量太少。C. 匀浆后样品未在室温放置5min。D. 水相中混有有机相。E. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解。RNA降解A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。B. 样品或提取的RNA沉淀保存于-5-20,未在-60-70保存。C. 细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。D. 溶液或离心管未经RNase去除处理。E. 电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。DNA污染A. 样品匀浆时加的试剂体积太少。B. 样品中含有组织溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液。 蛋白和多糖污染A. 样品
9、中蛋白、多糖含量高。B. 样品量太大。C. 水相中混有有机相。D. 第6步中加入RNA助沉剂可以帮助去除这些污染。RNA提取一般步骤总结RNA提取原理: 通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解。但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃。RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即:样品细胞或组织的有效破碎;有效地使核蛋白复合体变性;对内源RNA酶的有效抑制;有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离;对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑
10、制酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸,再用氯化锂将RNA沉淀出来;直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失,目前该方法的使用频率已很低。实验步骤:破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA。1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入-ME可以抑制RNA酶活性。2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开。3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc(pH-5
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