(本科)7第4章 基因组测序技术ppt课件.ppt
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1、课程主讲人:(本科)7-第4章 基因组测序技术ppt课件DNA测序速度在过去测序速度在过去30年中以几何级数递增年中以几何级数递增DNADNA的复制为半的复制为半保留复制。由于保留复制。由于DNADNA单链复制延单链复制延伸时只能以核苷伸时只能以核苷酸单体的酸单体的5-5-磷磷酸基团与前一个酸基团与前一个核苷酸的核苷酸的3-3-羟羟基缩合生成磷酸基缩合生成磷酸酯键。因此酯键。因此DNADNA复制复制是以是以5533方式进行。方式进行。一个理想的一个理想的链终止法链终止法测测序序DNADNA聚合酶聚合酶应该具有应该具有以下特点:以下特点:1 1)复制时可有效复制时可有效掺入双掺入双 脱氧核苷酸脱
2、氧核苷酸或其它修或其它修 饰类似物(如荧光标饰类似物(如荧光标 记);记);2 2)具有较高的具有较高的加工性能加工性能;3 3)在在缺少外切核酸酶活缺少外切核酸酶活 性性时仍然具有很高的时仍然具有很高的 保真度保真度;4 4)能产生能产生清晰的一致的清晰的一致的 信号信号用于读序。用于读序。天然天然DNADNA聚合酶不能直接聚合酶不能直接 用于用于DNADNA测序测序,必须,必须 进行进行改造改造。1 1)Klenow Klenow (E.coli DNA(E.coli DNA聚合酶片段聚合酶片段) ): 加工性能低(加工性能低( 15 nt ),具),具5 3和和3 5外切核酸酶活性;外切
3、核酸酶活性;已弃用已弃用2 2)T7 DNA PolT7 DNA Pol: : 需硫氧还蛋白辅助需硫氧还蛋白辅助,加工性能达,加工性能达 800 nt,具,具3 5 外切核酸酶活性,外切核酸酶活性,保真度高保真度高;常规测序常规测序3 3)Taq DNA PolTaq DNA Pol: : 耐热聚合酶耐热聚合酶(最适温度(最适温度7272O O C C,100 nt/sec),),缺缺3 5 外切核酸酶活性,外切核酸酶活性,保真度低保真度低,错错配率配率1/9 000,合成,合成3 -端具端具A突出;突出;PCR测序测序4) 4) PfuPfu DNA PolDNA Pol: : 耐热聚合酶耐
4、热聚合酶(最适温度(最适温度7272O O C C ,10 nt/ sec),具),具 3 5 外切核酸酶活性,外切核酸酶活性,保真度高保真度高,错配错配率率1.3/106,3 -端平端,端平端,加工性能差加工性能差;辅助;辅助 PCR测序测序目前普遍采用的测序酶为目前普遍采用的测序酶为T7 DNA聚合酶的聚合酶的改造型改造型T7 Sequenase和改造型和改造型Taq DNA Pol。噬菌体噬菌体T7 DNA聚合聚合酶的特点如下:酶的特点如下:1)T7 DNA聚合酶的体聚合酶的体内活性需要内活性需要硫氧还蛋硫氧还蛋白白,可提高,可提高T7 Pol加工性能加工性能100倍倍, 从一从一次延伸
5、数个次延伸数个nt到一次到一次延伸延伸800 nt;2)T7 DNA聚合酶聚合酶缺少缺少5 3外切核酸酶活性外切核酸酶活性;3)T7 DNA聚合酶聚合酶具有很强的具有很强的单链和双单链和双链链DNA 3 5外切核外切核酸酶活性酸酶活性,这一活性,这一活性受受EDTA,还原剂及,还原剂及铁离子等影响。铁离子等影响。T7 DNAT7 DNA聚合酶聚合酶结构简单结构简单,复制效率好于大肠杆菌,复制效率好于大肠杆菌DNADNA聚聚合酶合酶I I(DNA polymerase IDNA polymerase I)的)的KlenowKlenow片断,后者加工片断,后者加工性能只有性能只有15nt15nt。
6、 AMVAMV逆转录酶可达逆转录酶可达200nt, 200nt, 但复制速率但复制速率太低,每秒仅延伸数个核苷酸。此外,太低,每秒仅延伸数个核苷酸。此外,T7 DNAT7 DNA聚合酶最聚合酶最大的优点是不排斥大的优点是不排斥ddNTP,ddNTP,适合适合SangerSanger法测序。法测序。1 1) T7 DNA PolT7 DNA Pol: : 消除消除3-53-5外切核酸酶活外切核酸酶活 性,性,提高提高产生产生一致性的清晰条带一致性的清晰条带;2 2)Taq DNA PolTaq DNA Pol: : 消除排斥消除排斥ddNTPddNTP的倾向的倾向,提,提 高合成效率。高合成效率
7、。T7 DNA聚合酶用于聚合酶用于Sanger法测序的一法测序的一个个阻碍阻碍是其是其3 5外外切核酸酶活性切核酸酶活性,在,在dNTP溶度降低溶度降低时会时会干扰测序干扰测序,甚至降解,甚至降解DNA。通过突变去除。通过突变去除天然天然T7 DNA聚合酶聚合酶28aa组成的外切核酸组成的外切核酸酶活性结构域中酶活性结构域中144-157 aa可使可使3 5外切外切核酸酶活性丢失核酸酶活性丢失,但,但不影响其聚合酶功能不影响其聚合酶功能。耐热性耐热性DNA聚合酶聚合酶在在PCR循环测序中循环测序中有特别的优势,但有特别的优势,但有有排斥排斥ddNTP的倾的倾向,可达向,可达10 000倍倍。这
8、一特点这一特点决定决定于于DNA聚合酶中的聚合酶中的单单个氨基酸个氨基酸(T7, 526F,苯丙氨酸苯丙氨酸; DNA聚聚合酶合酶 I, F762,酪氨,酪氨酸酸; Taq , F667)。)。更换更换这一这一氨基酸氨基酸,可可消除消除聚合酶对聚合酶对ddNTP的排斥的排斥倾向。倾向。注:聚合酶注:聚合酶O螺旋位置苯丙氨酸排斥螺旋位置苯丙氨酸排斥ddNTP 第一代第一代DNA测序的特点:测序的特点: 1)间断测序间断测序(双脱氧核苷酸)(双脱氧核苷酸) 2)单一测序单一测序 (单一模板(单一模板DNA) 3)携带标记携带标记(同位素或荧光)(同位素或荧光) 4)限长测序限长测序(长度有限)(长
9、度有限)第一代第一代DNADNA测序的原测序的原理是依据理是依据SangerSanger设计设计的双脱氧核苷酸渗入的双脱氧核苷酸渗入法,必须同时法,必须同时分别进分别进行行4 4组反应组反应。每组反。每组反应中都有一种不同的应中都有一种不同的用用3232P P同位素标记的同位素标记的双脱氧核苷酸加入双脱氧核苷酸加入DNADNA复制单个反应液复制单个反应液。终止反应双脱氧核。终止反应双脱氧核苷酸的位置可以通过苷酸的位置可以通过测序凝胶测序凝胶DNA电泳电泳检测,经检测,经X-光片曝光光片曝光显示。根据显示。根据每个泳道每个泳道相邻的碱基条带相邻的碱基条带推测推测DNA序列。序列。双脱氧核苷酸的双
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