拟南芥对蓝光响应的隐花色素.doc
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1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流拟南芥对蓝光响应的隐花色素.精品文档.拟南芥对蓝光响应的隐花色素(CRY2)核小体的形成与CRY2的蓝光依赖性退化有关摘要:拟南芥隐花色素(CRY2)对花萌发的光周期有促进作用,对蓝光下胚轴伸长有抑制作用。据推测,由于光激发,CRY2的C -末端从N -端PHR的域脱离,从而形成cry2的去阻遏。为了检验这一假设,我们分析了绿色荧光蛋白(GFP)与CRY2在N端或者C端融合的活性。GFP - CRY2发挥光依赖的生化和生理活动与内源性的CRY2相似,而CRY2-GFP表明这两个基因生化和生理活动的组成性。CRY2 - GFP是结构性磷酸化,它
2、促进了黑暗和光下的去黄化,并激活的长日照和短日光照花芽分化。这些结果与假设是一致的,即光激发致使CRY2的C -末端从PHR域脱离,并激活CRY2。令人惊讶的是,我们发现,CRY2-GFP,形成了独特的蓝光响应核小体,而不是GFP - CRY2。与GFP- CRY2或内源性的CRY2相比,CRY2-GFP的降解使其对蓝光的应答显著变缓,这表明核小体的形成是由于光激发未降解的CRY2-GFP的积累。根据这一解释,我们发现,在26S-蛋白酶抑制剂(能够阻止蓝光依赖性的CRY2降解)的存在下, GFP- CRY2和内源性CRY2 形成了核小体。引言隐花色素是蓝光受体,介导植物和动物的生长发育及其生物
3、钟的光调节。拟南芥隐花色素CRY1和CRY2的主要功能分别是调解蓝光下胚轴伸长和促进花芽分化的光周期,虽然两个光受体的功能也有重叠。隐花色素有两个域,负责光吸收的N端PHR域(光修复酶同源区),和可能充当效应结构域的C端区域。相关的隐花色素光活化的分子机制还不十分清楚。几个有趣的假说被提出来,解释了在拟南芥中隐花色素的早期信号转导过程的不同方面。这些研究表明,涉及隐花色素的植物信号转导的早期阶段与几个不同的分子反应有关。例如,隐花色素黄素生色团的光还原反应(完全氧化的FAD到中间激发态FADH)与他们的生理活动有关。另一方面,光激发的隐花色素分子可能结构发生改变,以触发其磷酸化,从而导致它与其
4、它信号蛋白在一个开放的构象中互作来调节基因表达和反应,最终导致光受体的泛素/ 26S蛋白酶体的降解。然而,开放构象假说提出了主要基于敲除隐花色素的转基因植株中表达融合蛋白片段的研究,并没有证实存在隐花色素同源蛋白。大多植物的隐花色素是核蛋白质。拟南芥CRY1的表达产物穿梭于细胞核和细胞质之间,并在两个位置起作用。而CRY2在细胞核中完成其翻译后的生命周期。然而,CRY2在细胞核哪个部位履行其功能和/或修饰与降解仍不清楚。据发现,CRY2与红色荧光蛋白在烟草的原生质体中瞬时表达形成了斑点,也认为是核小体。由CRY2-RFP形成的核小体在形态上与红色/远红光受体光敏色素A和光明色素B的核小体类似。
5、CRY2和phyB在光依赖性核小体里互作,支持了两感光受体功能相互依存的方式起作用的假设。另一方面,它也知道,E3泛素连接酶COP1与GUS-CCT1(C端CRY1域)的融合蛋白相互作用。像哺乳动物细胞泛素/蛋白酶体结构的某些成分,拟南芥COP1能够形成核小体和吸收GFP-CCT1进入到核小体。可以猜想,隐花色素,光敏色素,和COP1可能通过同如被定义为核小体的超级蛋白复合物协作而产生互作。然而,CRY2的亚细胞定位和功能/调节的关系似乎更复杂。例如,据报道,在拟南芥中内源性的CRY2和瞬时或稳定表达生理活性的GFP-CRY2和GFP - CRY1融合蛋白没有核小体形成。此外,无论COP1与C
6、RY2特异互作,还是作为CRY2的主要E3泛素连接酶仍存在争议。 在白化苗暴露于蓝光下,CRY2是被泛素化且被26S蛋白酶体降解,但在E3泛素连接酶在这个过程所起的作用尚不清楚。虽然在两个cop1的弱等位基因突变体中(cop1-4 and cop1-6),CRY2依赖蓝光性降解受到抑制,但是CRY2仍然会在COP1无效突变体(COP1- 5)中降解。这些结果表明,需要有更多的研究来阐明伴随着CRY2感光体不同的生化反应的亚细胞定位和与相关机制。为了证实隐花色素同源蛋白构象假说,我们研究了两个融合蛋白,CRY2-GFP和GFP-CRY2。令我们惊讶的是,我们发现CRY2-GFP ,而不是GFP-
7、CRY2 ,在暴露于蓝光下的白化苗中形成明显的核小体。CRY2-GFP 形成核小体的反应与融合蛋白对蓝光应答而产生的降解的延迟相关。结果显示,不形成核小体的GFP-CRY2在26S蛋白酶抑制剂抑制的存在下形成核小体。此外,我们还观察到明显的不同,虽然在蓝光应答下,内源性CRY2形成核小体相对薄弱,但是,在蛋白体抑制剂的存在下,内源性CRY2形成核小体明显增强。我们推测,cry2核小体可能是与光受体的蓝光诱导降解有关的超分子复合物。结果CRY2-GFP(GFP与CRY2的C端融合)抑制光受体的生理活动基于利用截断隐花色素片段在转基因植物中表达的研究,光诱导开放构象假说被提出来解释拟南芥隐花色素分
8、子如何应答蓝光。根据这一假说,PHR和一个非磷酸化隐花色素的C -端区域,如CRY2,互作形成一个封闭的构象,这个构象是在黑暗条件下是无活力的。吸收光子后,隐花色素的C -末端结构域磷酸化且产生静电排斥,或从PHR的域表面脱离。这形成一个开放的构象,导致感光受体受到抑制。由于CRY2的辅助的C -端区域相对较小,本质非结构化,我们推测,报告蛋白,如GFP,附着到CRY2的C-端,辅助黏住C -端的域,将其从PHR域拉下来,造成黑暗条件下的无活力根据公开的构象假说,我们进一步推断,这种融合蛋白可能是组成型活性。为了检验这种可能性,我们比较表达GFP-CRY2或GFP-CRY2的转基因植物光形态反
9、应。在突变体cry1cry2的背景下,表达GFP-CRY2 的植物呈现出辅助蓝光和长日照(LD)的依赖性光形态建成(图1,图2)。GFP-CRY2 的转基因表达,拯救了突变体cry1 cry2亲本 蓝灯诱导特异长下胚轴(图1B to 1D)和长日照诱导特异晚花(图2A和2B)的表型。GFP-CRY2,CRY2-GFP 的对比表明,在相同的遗传背景蓝光和长日照的活动是独立的。CRY2-GFP/cry1 cry2 植物的表型与表达GUS-CCT2 、GUS-NC80的 转基因植物或者cop/det 的突变体表型相似。在所有的测试条件下(包括蓝光,红光,远红光,暗),CRY2-GFP/cry1cry
10、2的幼苗发育成短的下胚轴和膨大的子叶(图1B to 1D;,见参考图2在线)。CRY2不依赖蓝色光的活性不是由于一个不寻常的高表达水平,因为转基因株系中没有一个株系高于CRY2- GFP的测试水平(图1A高,见参考图1网上),这意味着CRY2-GFP将CRY2从一个依赖于蓝光的光受体转变成不依赖于蓝光的具备生理活性的蛋白。与这概念一致的是CRY2- GFP是组成型的,在光反应中正常表达的基因也会在黄化苗中表达。在缺乏光线条件下,CRY2-GFP/cry1 CRY2的仍显示质体的发育(图1F)。例如,黄化野生型细胞与cry1 cry2 突变体幼苗的细胞显示具备prolamellar结构和缺乏内部
11、膜的典型的白质体状图1F,野生型(D)条。短暂的蓝光照射刺激内部膜发育图1F,野生型(b)。与此相反,在完全黑暗条件下,突变体cop1幼苗的白色质体表现出更多的先进的内部膜堆叠和prolamellar结构的缺乏,仿佛突变体是在光下生长图1F,cop1(d)。同样,表达CRY2-GFP 的白化幼苗细胞也有显著的膜发育,包括圆形,堆叠,内膜增厚结构图1F,CRY2- GFP- 2(D)和CRY2-GFP-3(D)。图1:CRY2-GFP在无蓝光情况下抑制下胚轴伸长,而GFP - CRY2的抑制作用需要蓝光(A)GFP-CRY2 和CRY2-GFP 融合蛋白表达在三个独立的各基因型株系水平测试。从5
12、 d的黄化苗提取总蛋白质。被探测的免疫抗CRY2,分离并与抗泡焦磷酸酶(vPPase)再杂交。(B)指示基因型幼苗的下胚轴长度。幼苗5天生长在黑暗中或在连续蓝光(35.6 mol m-2s-1),红光(9.8mol m-2s-1),或远红光(3mol m-2s-1)。误差线显示标准差(n 20)。(C)关于在(B)所使用的基因型代表幼苗比较。(D)对三个独立表达CRY2- GFP的蓝色光下连续种植5天转基因株系进行了分析。如图所示的胚轴长度和标准差(n 20)。(E)采用RT - PCR检测显示CAB3和CHS基因,通常不会在6 天的黄化野生型、cry1 CRY2或GFP - CRY2苗中表达
13、,而在CRY2- GFP和COP1-6的 6 d黄化苗中高度表达。 UBQ表达的是作为对照组。(F)透射电子显微镜(TEM)图像显示在基因型6 d的黄化苗质的发展变化。D,黄化苗; B,一个简短的蓝光照射(100秒; 104mol m-2s-1)。除了幼苗生长发育不依赖蓝光的活力,CRY2-GFP 还具有成株不依赖光周期活力。在与GFP-CRY2/cry1 cry2 拯救晚花对比,长日照下cry1 cry2 亲本的表型在短日照条件下对开花时间没有显著的影响,无论是在长日照还是短日照条件下,GFP-CRY2/cry1 cry2 的开花时间都要比cry1 cry2 亲本的早。由于突变体cry1 c
14、ry2在长日照而不是短日照下延迟开花,CRY2-GFP/cry1 cry2 在短日照下加速开花代表了增益功能型表型。该CRY2- GFP的活性是不依赖内源性CRY2的,因为相同的增益功能表型是在CRY2 GFP/cry1植物中观察到(见参考图3和4在线)。图2(左边)。光周期独立CRY2- GFP的活性调节开花时间。(A) 40或60天龄的基因型植物分别在长日照(16 小时光照/ 8 小时黑暗)或短日照(8小时光照/16小时黑暗)中生长。有些植物捆绑在一起,以更好地显示在单独的盆中。(B) 开花期根据开花时间或莲座叶在开花期的数量测量 。 图3(右边)。光依赖的CRY2、GFP-CRY2,和
15、CRY2-GFP的构象变化模型。CRY2的PHR域的结构进行了计算建模,与已知的CRY1的 PHR域的结构不一样。表面拓扑结构和静电势(红色,带负电荷,蓝色,带正电荷)已经显示。该CRY2的辅助C端结构域被武断提出。绿桶描绘绿色荧光蛋白。红色圆圈描绘的CRY2 C -端结构域的磷酸化残基。由于CRY2- GFP和GFP-CRY2都包含 CRY2的全长序列,并且CRY2-GFP 蛋白的稳态水平不比GFP-CRY2的高(图1A,见参考图1网上),CRY2- GFP不依赖蓝色光及光周期独立的活动可以被解释了,GFP附着到CRY2的C端引起了CRY2-GFP 类似于光激发CRY2的构象变化(图3)。然
16、而,CRY2-GFP 似乎保留光响应。 在光线下CRY2-GFP 呈活性增加,无论光的波长和能量密度率(图1D,见参考图2在线)。这种现象是组成型融合蛋白GUS - CCT2和GUS - NC80的影子,和突变COP1一样不含有 PHR 生色团结合域。可想而知,这光效是由CRY2- GFP和光敏色素或COP1的互作引起的。CRY2-GFP是组成型磷酸化众所周知,CRY2是蓝光依赖性磷酸化。据推测,光激发改变CRY2的构象进而引发的磷酸化,并带来了进一步的构象变化,激活感光受体最终启动其泛素化和降解。根据这一假说及以上讨论的观点,CRY2-GFP引发一个类似于光激发CRY2的构象改变,一种可能期
17、望是组成型磷酸化。因此,我们研究了CRY2-GFP 磷酸化在cry1或cry1cry2突变体背景表达。这些突变体表现出类似的表型(图1,图2,见参考图3和4在线),但CRY2-GFP/cry1突变体同时允许都检测CRY2-GFP和内源性CRY2。事实上,虽然蓝光增强磷酸化反应(图4B),但是CRY2- GFP融合蛋白的确显示构磷酸化(图4A和4B)。由于CRY2是多个丝氨酸残基的磷酸化,CRY2- GFP 磷酸化的影响构成部分是可以想象的 ,而不是全部丝氨酸残基,使得CRY2的磷酸化是在蓝光仍略有增加。有趣的是,在表达CRY2-GFP 的转基因苗(cry1的突变体背景)中内源性CRY2也成为组
18、成型磷酸化(图4a和4b)。CRY2- GFP究竟如何影响内源性CRY2磷酸化仍不清楚。然而,由于隐花色素通过PHR域形成二聚体,可以猜想CRY2-GFP 磷酸化可能与内源性CRY2互作,使内源性CRY2在黑暗中磷酸化。此外,目前还不清楚,CRY2-GFP 本身是否可能作为激酶。虽然CRY1已被证明在体外自磷酸化,而CRY2自磷酸化还没有被成功证实。因此,无论CRY2-GFP 直接或间接导致的内源性CRY2反磷酸化还然而,调查结果显示,GFP-CRY2 仍然是依赖光的磷酸化和生理反应,而假定CRY2-GFP 是光依赖磷酸化和生理活动来支持这一假设,光激发改变CRY2的构象并激发它的活性。有待进
19、一步研究。图4。GFP- CRY2和cry2 - GFP融合蛋白的蓝光依赖性磷酸化和降解。(A)和(B)暴露于蓝光(26mol m-2s-1 )6 天的黄化苗在体内磷酸化为15分钟。两个独立的实验结果显示。对于GFP-CRY2 (即B右半边)的结果曾作为一个对照标准被发表。括号和星号分别代表CRY2-GFP(或GFP - CRY2)和内源性CRY2。(C)免疫印迹显示5 d蓝光照射 (14mol m-2s-1 )的黄化苗的GFP - CRY2和cry2 - GFP 的水平。(D)及(E)代表免疫印迹显示,从在黑暗中生长或持续蓝光下生长(2mol m-2s-1)5天的种苗表达GFP-CRY2 或
20、CRY2-GFP的 蛋白样品中系列稀释。在免疫印迹进行与抗CRY2杂交,分离并与抗焦磷酸酶抗体再杂交,或与丽春红S染色显示相对负荷。Xd表示稀释倍。在应答蓝光时CRY2- GFP的显示延迟降解鉴于CRY2磷酸化需要CRY2的泛素化、CRY2的降解,并且与GFP-CRY2 相比,CRY2-GFP是磷酸化(图4B),可以推测,在蓝光应答下甚至没有蓝光下,CRY2-GFP 降解反应比GFP-CRY2 快。令我们惊讶的是,在黄化苗暴露于蓝光下,CRY2-GFP 的降解速度比GFP-CRY2 慢(图4C)。黄化苗露于蓝光下,GFP-CRY2 呈现出与内源性CRY2相似的30min半衰期。相比之下,CRY
21、2-GFP呈现了长于4h的半衰期(图4C)。在暴露于蓝光的白化苗中,CRY2- GFP延迟降解,不是因为CRY2-GFP 的表达水平比GFP-CRY2 更高,这表明CRY2- GFP 见光不稳定。图5。 CRY2-GFP形成对蓝光的响应核小体,而不是 GFP-CRY2。(A)和(B)的荧光图像显示GFP-CRY2(A)或CRY2-GFP (B)核分布。GFP的荧光图像拍摄是从白化苗中分离出暴露于蓝光(22mol m-2s-1 )的时间B(min)的细胞核(7日龄),光照处理后,立即由4甲醛固定并显示。(C)CRY2-GFP的核小体通过绿色荧光蛋白与cry2结合的荧光显示。黄化苗暴露于蓝光15分
22、钟(20mol m-2s-1)并由4甲醛固定,分离出的细胞核与抗CRY2抗体和若丹明红- X的标记的羊抗兔IgG抗体进行了杂交。标线 = 5 m。有人注意到,在暴露于蓝光的黄化苗中,虽然 CRY2-GFP 的降解速度比GFP-CRY2 慢,但在连续蓝光下生长的苗中,CRY2-GFP 的积累的量并不比GFP-CRY2 高。这个令人困惑的结果让我们想起了之前报道的野生型植株内源CRY2的另一个观察结果。结果发现,在萌发芽及在蓝灯下生长5天的幼苗中检测到大量的CRY2,然而在暴露于同样的能量密度蓝光下4h的5天黄化苗中,CRY2 降解到检测不到水平。结果表明,存在一个反馈机制,抑制蓝色光依赖的CRY
23、2的泛素化和/或长时间蓝光照射下CRY2的降解,并且CRY2-GFP 是受到与内源性CRY2相同的反馈调节。仍然令人费解的是,虽然CRY2的磷酸化据报道是需要感光受体的生理活性和降解,但是为什么磷酸化的 CRY2- GFP 促进了生理活性却减少了降解仍不得而知。这种差异的一个可能的解释将是对生理活动相关的结构元素与CRY2的泛素化和降解所需的结构元素不完全相同。换句话说,由于 GFP 附着到CRY2的C端而产生的构象变化可能允许在没有光线下的磷酸化和活动,但它在某种程度上抑制了泛素或/和CRY2- GFP的降解。该假说推测,CRY2将与不同的蛋白质在光激发CRY2的同源蛋白的不同位置相互作用,
24、其中一些需要进行CRY2的功能,而其他的用来CRY2的泛素化和降解。这些蛋白质鉴定后,这个假设可能被验证。CRY2- GFP的形成对蓝光响应的核小体暴露于蓝光黄化苗的活细胞中,GFP-CRY2和cry2 - GFP的表现出截然不同的亚核分布(见在线版)。在这个实验中,黄化幼苗置于荧光显微镜,曝光时间30s。样品然后被蓝灯(490 nm)激发,在荧光激发后,GFP 的放射荧光的荧光图像,在每秒两次的速度抓拍。在20秒的荧光激发下,CRY2- GFP融合蛋白开始形成核小体,GFP的荧光被曝光后,而这些核小体在100秒内才可见(见在线版)。这些GFP-CRY2 核小体形态与以前烟草报道瞬时表达CRY
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