斑叶露兜树茎腐病病原菌的鉴定及其在植株体内的分布.doc
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1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流斑叶露兜树茎腐病病原菌的鉴定及其在植株体内的分布.精品文档.建议:1、前言说明研究的重要性,前人有研究吗,知道是什么菌,提高菌鉴定意义的说明。2、讨论中,要把研究的意义说出来,比如,明确了菌源,未见报道,为防治提供依据,3、我给你查了世界文献,不多,你看了后,说明几个问题,叶露兜树茎腐病有人鉴定过吗?Fusarium verticillioides 还可以发生在什么上面?前人都对这个研究作了什么?我们的研究要干什么。4、题目“斑叶露兜树茎腐病的发生特性及其病原菌分子鉴定”斑叶露兜树茎腐病病原菌的鉴定及其在植株体内的分布 收稿日期: 基金项目:
2、国家863计划项目(2006AA10A211)*通讯作者Author for correspondence(E-mail:fzliubo)肖荣凤,林抗美,郑雪芳,蓝江林,刘 波*(福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建,福州 350003)摘要:本研究分离与鉴定了引起斑叶露兜树茎腐病的病原菌并分析了病菌在该植株体内的分布特性。本研究采用常规病原菌分离方法、Booth镰刀菌鉴定方法及菌株的rDNA-ITS序列分析,确定从福建建新采集的斑叶露兜树茎腐病的病原菌为串珠镰刀菌明确了从福建建新采集的斑叶露兜树茎腐病的病原菌为串珠镰刀菌(Fusarium verticillioidesverticill
3、ioides)。,菌株的核苷酸序列在GENBANK中的登录号为EU717682。串珠镰刀该菌在斑叶露兜树植株体内的数量分布的研究结果表明,含菌量因植株部位和病情不同而有明显差异。就分离的部位而言,茎部的含菌量最大,其次为根部,而叶部的含菌量最少;就病情而言,病株的含菌量是无症株的23倍。关键词:斑叶露兜树;串珠镰刀菌; ITS序列分析;体内分布中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:Identification of Fusarium verticillioides causing root rot of Veitchs Screw Pine and distribution of the p
4、athogens inside the plantsXIAO Rong-feng, Lin Kang-mei, Zheng Xue-fang, LAN Jiang-lin, and LIU Bo(Agricultural Bioresource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)Abstract: The objectives of this study were to isolate and identify pathogen which caused root
5、rot on the plant of Pandanus veitchii Dall, and to determine the distributions of this isolate inside the plant.caused the symptoms: vascular wilt, yellows, root rot, and damping-off on Pandanus veitchii Hort. The result showed that the pathogen was Fusarium verticillioides which was isolated from t
6、he plant of P.veitchii , in Jianxin, Fujian province, PR China, and identified by using Booths method and the sequence of its rDNA-ITS. The resulted showed that the pathogen was identified as F. moniliforme已改学名. GenBank accession number for the isolation nucleotide sequence was EU717682. Meanwhile,
7、the distributions of F. verticillioidesthe pathogens were detected inside the symptomatic and asymptomatic P. veitchii plants to and find found that the amount of the pathogen was higher in the base stem than that in the root, and least in the leaves. The amount of the pathogen in the symptomatic pl
8、ant was 23 times higher than that in the asymptomatic plant. And the amount of the pathogen was 23 times higher in symptomatic plants than asymptomatic ones. It was the key for environment aeration within the plants to prevent the disease.英文中文化,建议重写Keywords: Pandanus veitchii Dall; Fusarium verticil
9、lioidesFusarium moniliforme; rDNA-ITS ; Identification; Distribution 斑叶露兜树(Pandanus veitchii Dall.),原产中南太平洋的波里尼西亚及其诸岛屿,现已成为世界流行的室内常绿观叶植物之一。斑叶露兜树叶形、叶色具有较高观赏价值,具簇生圆柱状肉质根和短的根状根,叶基生,条形至长披针形,全缘或稍波状,适宜于室内装饰,近年来我国也有广泛的引种栽培。在福州建新花卉基地发现部分观赏盆景斑叶露兜树出现茎腐病,表现为植株的茎部受害严重,且叶片也被不同程度的侵染,目前还未有关斑叶露兜树茎腐病相关病原菌的研究报道,。鉴于该作
10、物的经济与观赏价值、茎腐病所造成的严重为害以及该病害的相关病原菌未见报道,因此,为了弄清该病原菌具有重要的理论意义,并并为可为该病害的有效防治提供理论依据,。本文从采集了花卉基地采集了无症株及田间自然感病的植株及无症株进行病原菌分离,对其病原菌进行了鉴定,同时研究了病原菌在无症株与病株植株体内的分布情况。现将研究结果报道如下:1 材料与方法1.1 植株症状观察试验于2003年在福州建新花卉基地进行,观察到部份斑叶露兜树盆景植株的茎基部出现茎腐状,因此,拟采集无症株与病株各3株进行试验室的病害症状观察与病原鉴定株进行进一步的病害症状观察与病原鉴定。1.2 病原菌的分离与形态鉴定采用常规的组织分离
11、法进行病菌的分离(方中达,1998)。切取病株根茎处变色木质部,将新鲜病组织切成0.50.3 cm大小的薄片,经75酒精处理2 s,再用0.1升汞处理23 min,取出用无菌水清洗3遍,置于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)上培养,每皿放5片病组织,共分离15个样本,251.5 培养。3次重复。随机挑选10个有代表性组织块上的分离物进行单孢分离,分离纯化培养后采用-80 甘油冷冻保存。病原鉴定依据Booth(1971)的鉴定方法:单孢分离纯培养物,接在PSA培养基上,25 培养4 d,测定单孢菌落的生长速度,取培养15 d的培养物进行孢子形态及产孢细胞观察,测量各类型分生孢子长度与宽度。1.3病原
12、菌的致病性检测根据Koch氏法则进行分离物的回接测定。将1.2中的病原分离物扩大培养后中的单孢纯化保存的分离物扩大培养后,配成浓度为1.0106 cfu/mL孢子悬浮液,采用浸根接种叶长约为15 cm的盆栽苗,由于该植株根茎部组织较硬,采用的浸根时间为5 h,以清水处理的做对照,各处理10株,观察植株的发病情况并重新分离发病株的病原物。1.4 病原菌的分子鉴定1.4.1 rDNA-ITS区扩增采用CTAB法提取菌株DNA,引物设计合成参考杨红等(2002)方法,正向引物:5-CTTGCGTTGATTACGTCCC -3,反向引物:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3。PCR反应的
13、总体积为25 L,含有1个单位的Taq酶、10buffer 2.5 L、dNTP 0.2 L、10 umol/L的正向引物和反向引物各1 L、DNA模板25 ng。PCR扩增程序:94 预变性10 min,94 变性1 min,55 退火1 min,72 延伸2 min,共25个循环,最后72 延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。1.4.2 PCR产物的直接比对分析测序将回收的目的片断送交上海生工生物工程技术服务有限公司。序列结果通过国际互联网(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)进行核酸同源性检索,检索程序主要采用Blast,即核酸序列对核酸序列数据库的
14、检索。通过DNAStar软件中Clustal W方法及MEGA31软件进行序列分析。1.5 病原菌在斑叶露兜树植株体内的分布串珠镰刀菌在斑叶露兜树植株体内的分布根据症状观察与分离物形态鉴定结果,在福州建新采集斑叶露兜树无症株取1.1中采集的斑叶露兜树无症株(AS)与田间自然感病植株(S),分段取样。方法:选无症株与病株各1株,且各取6个样品,分别为根部1(正常根)、根部2(有褐变根)、茎部1(茎基部无病症处)、茎部2(茎上部有病症处,健康株无病症;如图2、3)、叶部1(心叶3片)、叶部2(老叶1片)。根部1、根部2、茎部1、茎部2各截取5 cm称重;叶部1、叶部2称重。用清水冲洗、升汞消毒、无
15、菌水漂洗后,加入无菌水100 mL,用匀浆器制成匀浆。梯度稀释涂平板,各吸取0.2 mL至含终浓度为200 u/mL链霉素的PSDA平板上,均匀涂布,在25 的培养箱中培养3 d。每个稀释度3次重复。采用平板菌落计数法统计镰刀菌单菌落数采用平板菌落计数法统计优势种群的单菌落数,计算各样品组织每克鲜重的含菌量。分析无症株(AS)与病株(S)植株体内的尖孢镰刀菌的分布状况植株体内的串珠镰刀菌的分布状况。这部分试验设计存在缺陷,病原菌没有经过标记,因此无法确定数量。2 结果与分析2.1 病原菌的分离与形态鉴定2.1.1 田间症状斑叶露兜树植株(图1)的根茎叶均可受到不同程度的感染,根部主要表现为变色
16、腐烂;茎基部则变色凹陷,严重时病斑上出现白色的菌丝体(图2箭头所示);病茎纵切面组织呈现褐色(图3-S),而健茎颜色正常(图3-AS);发病初期叶片出现零星褐色病斑,后期叶片枯萎。ASS茎2Stem 2茎1Stem 1ASS图1 斑叶露兜树植株Fig.1 Veitchs Screw Pine图2 病茎(S) 与健茎( AS); 茎1和茎2Fig.2 Symptomatic stem (S) and asymptomatic stem (AS),stem 1 and stem 2图3 病茎(S)与健茎(AS)纵切面Fig.3 Vertical section for symptomatic st
17、em (S) and asymptomatic stem (S)2.1.2 病原菌的形态鉴定供试验的15个组织样本中,有13个样本中出现白色的分离物。经单孢分离保存的菌株10株,编号为Fm-B.1.1-030221-01至Fm-B.1.1-030221-10。通过平板培养与显微观察结果表明,10个分离物具有相同的特征。在PSA培养基上生长4 d的菌落平均直径为45(4247) ) mm,菌丝白色至淡紫色,稀疏棉絮状(图4)。小型分生孢子数量多,呈椭圆形或卵圆形,大小17.9 (12.523.6)2.6 (2.23.0) m,在产孢细胞中串生,;大型分生孢子镰刀型,细长,顶端逐尖,3个隔膜的居多
18、,大小为26.6 (20.533.5)2.8 (2.53.8) m(图5)。产孢细胞单瓶梗,分枝或不分枝(图6)。依据Booth(1971)的鉴定方法,,串珠镰刀菌在PSA培养基上生长4 d的菌落直径大于25 mm,小型分生孢子多且串状着生,大型分生孢子镰刀状、较细、具3-5个隔膜,产孢细胞单瓶梗状,因此, 初步确定侵害该植株的病原菌为串珠镰刀菌(F. verticillioides)。图4 菌株在PSA培养基上菌落形态Fig.4 The colony of isolation on PSA mediuma图5 菌株的分生孢子形态小型分生了孢子:实线箭头所示;大型分生了孢子:实线箭头所示Fig
19、.5 The conidiophores of isolationmicroconidia : real line arrow,macroconidia : broken line arrow图6 菌株的产孢细胞(实线箭头所示)Fig.6 Conidiogenous cells of isolation(real line arrow)2.2病原菌的致病性检测 接种病原分离物的植株从25 d开始均出现不同程度的症状,症状表现为边缘叶片出现轻微的黄化萎蔫,根部褐变,茎部纵切可见维管束组织变褐色,而清水处理植株生长正常。对接种发病的根茎部病组织进行分离鉴定,获得了与接种前相同的微生物,证实了该病原
20、菌对斑叶露兜树植株的致病性。2.3 病原菌的分子鉴定利用引物P1/ ITS4 对供试菌株Fm-B.1.1-030221-01的rDNA-ITS区进行扩增,扩增图谱见图7。从扩增图谱可见,供试菌株扩增出单一条带,大小为700 bp左右。经测序表明,菌株的ITS长度为716 bp,序列已登录GENBANKGenBank,序列号为EU717682。序列结果通过国际互联网(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)用Blast进行同源性搜索,得到的同源序列全部是镰刀菌属不同的物种。并选择作物上主要镰刀菌属各2个菌株进行rDNAITS序列共同比对,利用Clustal W软件将序列匹配排列,用
21、MEGA31软件采用近邻归群法(Neighbor Joining,N-J)构建系统发育树从系统树可以看出(图8),供试验菌株与GENBANKGenBank中的2株串珠镰刀菌(F. verticillioides)AB237662及AF455422的同源性为99%,与2株类尖孢镰刀菌(F. oxysporum)AY18989EY DQ452450的同源性为92%,而与2株茄病镰刀菌(F. solani)的同源性仅为83%。根据Taylor(2000)等概述的用PSR(Phylogenetic Species Recognition) 作为鉴定真菌种的标准和Renske Landeweert(20
22、03)的丝状真菌分子分类原则:即通过菌株的即对菌株的ITS区域比对,丝状真菌在种间、种内遗传距离上有差异,序列相似性99,鉴别为相同种。因此,供试菌株的鉴定结果应为串株镰刀菌串珠镰刀菌(F. verticillioides),该结果与传统形态鉴定结果相一致。700 bp图7 rDNA ITS区段PCR扩增凝胶电泳图(M: mark; 1: 供试菌株)Fig.7 The electrophoresis of ITS PCR(M: mark; 1: tested isolation)图8 分离菌株及来自GenBankGenBank的镰刀菌属不同种的 rDNA-ITS序列构建的N-J系统发育树Fig
23、.8 The N-J phylogenetic tree based on ITS sequences of Fusarium strains download from GenbankGenBank.2.4 串珠镰刀菌在斑叶露兜树植株体内的分布试验结果见图试验结果见表1。串珠镰刀菌在斑叶露兜树植株体内的数量分布因植株部位和病情不同而有明显差异。就分离的部位而言,茎部的含菌量最大,其次为根部,而叶部的含菌量最少。在病株中,茎部中出现茎腐症状的茎2部位大约是未出现症状的茎1部位(图2所示)的含菌量的12倍,分别为1.47105 cfu/g-1鲜重和1.23104 cfu/g-1鲜重;根部中的有褐
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