沙门氏菌检测.doc
《沙门氏菌检测.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《沙门氏菌检测.doc(16页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流沙门氏菌检测.精品文档.沙门氏菌检测1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:1.1 冰箱:25。1.2 恒温培养箱:361,421。1.3 均质器。1.4 振荡器。1.5 电子天平:感量0.1g。1.6 无菌锥形瓶:容量500ml,250ml。1.7 无菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)或微量移液器及吸头。1.8 无菌培养皿:直径90mm。1.9 无菌试管:3mm50mm、10mm75mm。1.10 无菌毛细管。1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。1.12 全自动微生物生化
2、鉴定系统。2 培养基和试剂2.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见附录中1。2.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见附录中2。2.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见附录中3。2.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:见附录中4。2.5 HE琼脂:见附录中5。2.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见附录中6。2.7 沙门氏菌属显色培养基。2.8 三糖铁(TSI)琼脂:见附录中7。2.9 蛋白胨水、靛基质试剂:见附录中8。2.10 尿素琼脂(pH7.2):见附录中9。2.11 氰化钾(KCN)培养基:见附录中10。2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见附录中11。2.13 糖发酵管:见附录中12。2.14 邻
3、硝基酚-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见附录中13。2.15 半固体琼脂:见附录中14。2.16 丙二酸钠培养基:见附录中15。2.17 沙门氏菌O和H诊断血清。2.18 生化鉴定试剂盒。3 操作方法3.1 试验前准备3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管(1ml、10ml)、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量,避免操作中出入操作间。3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。3.1.3 操作人员用肥皂洗手,关闭紫外杀菌灯,进入缓冲间,换工作鞋,用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手,穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。3.1.4 操作前先用乙醇
4、棉球擦手、工作台面,再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围,待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。3.2 前增菌称取25g(ml)样品放入盛有225ml BPW的无菌均质杯中,以8000r/min10000r/min均质1min2min,或置于盛有225ml BPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需测定pH值,用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2。无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中,如使用均质袋,可直接进行培养,于361培养8 h18h。如为冷冻产品,应在45以下不超过15min,或25不超过18h解冻。3.
5、3 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1ml,转种于10ml TTB内,于421培养18 h24h。同时,另取1ml,转种于10ml SC内,于361培养18h24h。3.4 分离分别用接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于361分别培养18h24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板)或40h48h(BS琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1。表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养
6、基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。HE琼脂蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。3.5 生化试验3.5.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于361培养18h24h,必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验
7、培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA()()可疑沙门氏菌属KA()()可疑沙门氏菌属AA()()可疑沙门氏菌属AA/非沙门氏菌KK/非沙门氏菌注:K:产碱,A:产酸,:阳性,:阴性;()多数阳性,少数阴性;/:阳性或阴性。3.5.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于361培养18h24h,必要时可延长至48h,按表
8、3判定结果。将已挑菌落的平板储存于25或室温至少保留24h,以备必要时复查。表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢(H2S)靛基质pH7.2尿素氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶A1A2A3/注:阳性,:阴性,/:阳性或阴性。3.5.2.1 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶判定结果甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)沙门氏菌IV或V(要求符合本群生化特性)沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)注:阳性,:
9、阴性。3.5.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。3.5.2.3 反应序号A3:补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性。甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。3.5.2.4 必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别项 目IIIIIIIVVVI卫矛醇山梨醇水杨苷ONPG丙二酸盐KCN注:阳性,:阴性。3.5.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据3.5.1的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用
10、生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。3.6 血清学鉴定3.6.1 抗原的准备一般采用1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如23)培养基上再检查;如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.550.65半固体琼脂平板的中央,俟菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.30.4半固体琼脂的小玻管1 次2次,自远端取菌培养后再检查。3.6.2 多价菌体抗原(O)鉴定在玻片上划出2个约1cm2cm的区域,挑取1环待
11、测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。3.6.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定同3.6.2。3.7 结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(ml)样品中检出或未检出沙门氏菌。附录 培养基和试剂1 缓冲蛋白胨水(BPW)1.1 成分蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g磷酸氢二钠(含12 个结晶水) 9.0g磷酸二氢钾 1.5g蒸馏水 1000mlpH 7.2
12、0.21.2 制法将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10 min,煮沸溶解,调节pH,高压灭菌121 ,15min。2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液2.1 基础液蛋白胨 10.0g牛肉膏 5.0g氯化钠 3.0g碳酸钙 45.0g蒸馏水 1000mlpH 7.00.2除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH,高压灭菌121,20 min。2.2 硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠(含5个结晶水) 50.0g蒸馏水 加至100ml高压灭菌121,20 min。2.3 碘溶液碘片 20.0g碘化钾 25.0 g蒸馏水 加至100 ml将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘
13、片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。2.4 0.5煌绿水溶液煌绿 0.5g蒸馏水 100ml溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。2.5 牛胆盐溶液牛胆盐 10.0g蒸馏水 100ml加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121 ,20min。2.6 制法基础液 900ml硫代硫酸钠溶液 100ml碘溶液 20.0ml煌绿水溶液 2.0ml牛胆盐溶液 50.0ml临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种成分。3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液3.1 成分蛋白胨 5.0g乳糖 4.0g磷酸氢二钠 10.0
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 沙门氏菌 检测
限制150内