生物技术论文.doc
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1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流生物技术论文.精品文档.青霉素酶产生菌蜡样芽孢杆菌的筛选、纯化和诱导徐 冰(天津农学院 农学系)1 前言-内酰胺酶(青霉素酶)在自然界的各种细菌中广为存在, 能够水解各种-内酰胺类抗生素, 是临床致病菌最重要的耐药机制之一。但同时我们可以利用许多非致病菌产生的-内酰胺酶能够水解-内酰胺类抗生素的特点, 开发其在抗生素药品质量检验、新抗菌药物筛选等方面的应用。一些抗菌药物如青霉素、磺胺类药物、四环素及某些氨基糖甙类抗生素能使部分人群发生过敏反应。过敏反应症状多种多样,轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝织炎等;严重时可出现过敏性休克,甚至危及
2、生命。当这些抗菌药物残留于动物性食品中进入人体后,就使部分敏感人群致敏,产生抗体。当这些被致敏的个体再接触这些抗生素或用这些抗生素治疗时,这些抗生素就会与抗体结合生成抗原抗体复合物,发生过敏反应。英国一对青霉素高度敏感的病人,食用约含10 IU/ mL 青霉素的商品牛奶后,发生了变态反应。在我们平常的生活中由于青霉素的大量使用使环境遭到了破坏,给人类带来了不便。催化水解青霉素-内酰环产生青霉噻唑酸的一类-内酰胺酶。国际生物化学联合会(IUB)酶学委员会的酶编号为3.5.2.6。在各种微生物中分布广泛,特别在细菌中更为广泛。由蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus 5/B与B. cereus
3、 569分别得到分子量为35200与31500的青霉素酶结晶,从巨大芽孢杆菌B. megaterium 提取出,青霉素酶结晶,随后从不同细菌又分离出多种青霉素酶。青霉素酶对热极不稳定,分解-内酰胺的速度因青霉素与酶的种类不同而异,但对6-氨基青霉烷酸(6-APA)作用却很微弱。酶反应最适PH值为6.06.5. 以青霉素G钾盐为底物,Km为4.3210-3M(5/B酶);4.8910-3M(569酶)。细菌产生青霉素酶导致出现耐药性,临床上已分离出多种类型青霉素酶,白色粉末。分子量50000。溶于水。酶溶液易失活,冻干品28可稳定一周。青霉素酶作用于青霉素的-内酰胺环,使青霉素转变为无抗菌活性的
4、青霉素酮酸(penicilloic acid)。医疗上用于青霉素过敏症状的治疗。青霉素酶在实验中用于破坏或抑制青霉素活性-内酰胺酶(-lactamase),可水解-内酰胺类抗生素。已发现二百多种-内酰胺酶。青霉素酶的分类方法主要有两种,分子生物学方法和BUSH法。 分子生物学法将酶分为四类。A类酶包括多种质粒编码的青霉素酶,活性部位为丝氨酸残基,分子量为29kDa。B类酶为金属酶,由染色体或质粒编码,酶活性需锌离子参与,可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制。C类酶的活性部位为丝氨酸残基,分子量为39kDa,其产生与诱导剂有关。C类酶主要指染色体编码的头孢菌素酶(AmpC酶)。D类酶又称为OXA型(
5、水解苯唑西林)-内酰胺酶。另一种分类方法为BUSH分类法,依底物及抑制剂谱不同,也将酶分为4类。第一类为头孢菌素酶(AmpC酶),由染色体介导。第二类为青霉素酶和超广谱酶。第三类为金属酶。第四类为其它不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶。由于青霉素的大量使用和乱用带来的一些危害,我们有必要来生产青霉素酶来分解青霉素,这样可以减少一些青霉素过敏反应带来的危害,也可以减少乱用青霉素带来的环境污染。这使青霉素敏感人群的安全性得到了进一步的提高,使我们的环境更加安全。青霉素G 是目前医药工业中的最重要抗生素类产品,具有抗菌活性强,疗效高,毒性低等优点,一直是治疗敏感性细菌感染的首选药物。我国青霉素年生产能
6、力达到12000 吨以上,占全球年产量的50 % ,是世界青霉素生产大国2。青霉素G结构中的-内酰胺环不稳定,在酸、碱、高温、酶等作用下发生降解,生成的物质易与蛋白或多肽结合,生成致敏性高分子杂质,导致过敏反应的发生3 。青霉素过敏反应表现形式多种多样,以过敏性休克最为严重,常常发病迅速。其临床症状主要表现为呼吸道阻塞症状(呼吸困难、胸闷);循环衰竭(大汗淋漓、紫绀、脉搏细弱、血压下降);中枢神经系统紊乱(意识障碍、昏迷、抽搐、大小便失禁等)。目前工业生产中大多采用溶媒萃取法从发酵液中分离青霉素G,pH1182. 5 时用乙酸丁酯进行萃取,pH6.88.0 时用碳酸氢钠进行反萃取,然而收率只有
7、80 %90 % ,据文献报道4 ,其主要原因由青霉素G不稳定降解造成。医学界流行一句话: 在美国买枪很容易, 但买抗生素却很难, 而中国正好相反。目前, 中国的门诊感冒患者约有75% 应用抗生素, 外科手术则高达95% , 世界卫生组织调查表示, 中国住院患者抗生素药物使用率高达80% , 其中使用广谱抗生素和联合使用两种以上抗生素的占58% , 远远高于30% 的国际水平5。 专家说凡超时、超量、不对症使用或未严格规范使用抗生素, 都属于抗生素滥用6。我们常看到这样的一种现象: 只要病人一到医院或诊所就医, 不管有没有感染症状, 医生动不动就上抗生素, 甚至全然不顾抗生素的副作用, 把抗生
8、素当成预防和治疗感染的常规。 与此同时, 家庭中抗生素使用率也相当惊人, 缺乏医学知识的群体对抗生素推崇备至, 许多家庭长期备有各种抗生素, 一有风吹草动, 边随便服用.临床上, 乱用、滥用抗生素现象有以下方面:1) 对疾病发病原因不明而乱用抗生素。如用抗生素治疗流行性感冒和非细菌引起的喉病和肺炎等, 这些疾病均非细胞感染所致, 应用抗生素实无必要且不效, 因而, 感冒不一定要用抗生素7。2) 随意选用新型广谱抗生素治疗普通抗生素就能治愈的疾病。这种“大炮打蚊子”式的用药方法, 不仅易导致细菌耐药, 而且造成大量浪费。3) 不辨明致病菌类型而盲目求新、求贵、错误地以为, 药愈新, 价格愈贵,
9、疗效愈好,“撒大网”式的多种抗生素联用等。4) 由于对抗生素的作用机理、抗菌谱和药代动力学参数等不明或知之甚少, 临床使用时, 抗生素的选用及剂量、疗程和给药途径等不当。5) 药品广告的管理存在问题。大量媒介上可见抗生素广告, 病人上医院指定医生开广告上宣传的药品,即用药跟着广告走。6) 随病人要求开人情处方。为了医院创收, 鼓励医生大量用第二代和第三代头孢菌素等进口抗生素, 或为了促销, 用手中的钱去换医生手中的笔等。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌种蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63301(Bacillus cereus),天津市大康科技股份有限公司。2.1.2 培养基(1)初始固体培
10、养基(肉汤培养基):10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g NaCl、1L水,加热,调PH7.27.4,加入20g左右的琼脂。(2)液体发酵培养基:蛋白胨15g、甘油50g、氯化钠4g、0.1硫酸亚铁(FeSO47H2O)溶液0.5mL、枸橼酸钠5.88g、20硫酸镁(MgSO47H2O)溶液1mL、磷酸氢二钾4g、肉浸液1000mL。混合上述成分,调节pH值使灭菌后为7.07.2,分装于500mL锥形瓶内,每瓶80mL,在115灭菌30分钟。2.1.3 主要仪器ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂PH050A型 培养箱/干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司旋转式恒温调速摇瓶柜
11、 上海欣蕊自动化设备有限公司电子天平(FA2004) 上海精科天平电子天平 梅特勒-拖利多仪器(上海)公司2.2 方法利用浓度梯度平板筛选法筛选高产菌株,其中青霉素既是诱导剂也是筛选条件。2.2.1 具体方法2.2.1.1 液体发酵首先用原始菌种进行发酵实验,确定其产酶效率:酶溶液的制备取蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CMCC(B)63301的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25摇床培养18小时后,取此培养物接种至其余各瓶培养基内,每瓶接种10mL,同时每瓶加入无菌青霉素4500单位,在25摇床培养24小时,再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,再加无菌青霉素2万单位,
12、继续培养24小时,离心沉淀菌体,调pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌,滤液用无菌操作调pH值至近中性后,分装于适宜容器内,在10以下贮存。青霉素活性测定选用754紫外光度仪中时间扫描程序,检测波长232 nm; 37 恒温;检测池加入各种溶液的体积总和为3 mL(310-2 mol.L-1青霉素G溶液0.1 mL, 待测青霉素酶液0.01 mL,pH 7.0磷酸缓冲液2.89 mL)。混合后立即进行测定,可得到青霉素G被青霉素酶水解的动力学谱图和变化速率。通过对水解前后该波长下吸光度变化的测定,可得到吸光度变化与青霉素G浓度变化间的相关参数,最后测得青霉素酶活性,以国际单位计(mol.L-1.m
13、in-1)。2.2.1.2 筛选进行浓度梯度平板筛选:设定青霉素单位浓度分别为:150单位/mL、200单位/mL、250单位/mL、300单位/mL、350单位/mL、400单位/mL。因为青霉素在溶于水后分解速率加快,而且随温度的升高其分解速率越来越快,从而使青霉素诱导失去作用。所以要在培养基灭菌后,在培养基还未凝固时加入溶解好的青霉素溶液。取400单位/mL的培养基上的两个菌落转接于十支试管斜面内,进行传代培养,同时检测其产酶效率。通过检测发现经过3到4代的传代,其产酶效率有所下降,怀疑是由菌种退化造成的,所以在传代培养基内加入青霉素以保持菌活性。2.2.1.3 再次筛选再次进行浓度梯度
14、筛选:设定青霉素单位浓度分别为:300单位/mL、400单位/mL、500单位/mL、600单位/mL。重复以上实验过程,最终将青霉素单位浓度提升到1200单位/mL。2.2.2 菌种生长曲线的测定:2.2.2.1 标记取11支无菌大试管,用记号笔分别标明培养时间。即0h,4h,8h,12h,16h,20h,24h,28h,32h,36h,40h,44h。2.2.2.2 接种分别用5mL无菌吸管吸取2.5mL蜡样芽孢杆菌培养液(培养18h左右)转入盛有60mL肉汤培养基的三角瓶内,混匀后分别取5mL混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。2.2.2.3 培养将已接种的试管置摇床37震荡培养(震
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