菌悬液与菌片的制备.docx
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1、 菌悬液与菌片的制备2.1.1.2.1 适用范围制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片,以供消毒剂杀菌试验时使用。2.1.1.2.2 试验器材(1)菌种:金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、铜绿假单胞菌 ATCC 15442、大肠杆菌 8099、枯草杆菌黑色变种 ATCC 9372、龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326、白色葡萄球菌 8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌 ATCC16404。在上述规定的菌株基础上,根据消毒剂特定用途或试验特殊需要,还可增选其他菌株。(2)有机干扰物:见附录 A。(3)磷酸盐缓冲液:见附录 A。(4)无菌蒸馏水。(5)稀释液:见附录 A。(6)细菌培
2、养基:胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA),胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)等,见附录 A。(7)革兰染色液:见附录 A。(8)芽孢染色液:见附录 A。(9)恒温水浴箱。(10)玻璃漏斗。(11)刻度吸管(1.0ml、5.0ml、10.0ml),毛细吸管。(12)数字可调移液器(10l, 20l, 100l,200l,1000l)及配套用一次性塑料吸头。(13)离心机。(14)电动混合器(15)浊度计。2.1.1.2.3 细菌悬液制备程序(1)细菌繁殖体悬液的制备1)取冻干菌种管,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。取含 5.0 ml10.0ml 营养肉汤培
3、养基试管,滴入少许菌种悬液,置 37培养 18h24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,于 37培养 18h24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落,接种于营养琼脂斜面,于 37培养 18h24h,即为第 3 代培养物。2)取菌种第 3 代14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h24h),用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml5.0ml 稀释液加入斜面试管内,反复吹吸,洗下菌苔。随后,用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合(振荡)20s,或在手掌上振敲80 次,以使细菌悬浮均匀。3)初步制成的菌悬液,先用细菌浓度比浊测定法粗测其
4、含菌浓度,然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4)细菌繁殖体悬液应保存在 4冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5)怀疑有污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。(2)细菌芽孢悬液的制备1)取冻干菌种管,在无菌操作下打开,以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。取含 5 ml10ml 营养肉汤培养基试管,滴入少许菌种悬液,置 37培养 18h24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,于 37培养 18h24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落,接种于营养肉汤培养基,于 37培养 18h24h,即为第 3 代培养物。2)用 10.
5、0ml 吸管吸取 5.0 ml10.0ml 第 3 代5 代的 18h24h 营养肉汤培养物,接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面,将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面,再将多余肉汤培养物吸出,将罗氏瓶置于 37温箱内,培养 5d7d。3)用接种环取菌样少许涂于玻片上,固定后以改良芽孢染色法染色,并在显微镜(油镜)下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时,即可进行以下处理。否则,应继续在室温下放置一定时间,直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。改良芽孢染色法:用接种环取菌样涂布于玻片上,待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。将涂片放入平皿内,片上放两层滤纸,滴加足量的 5.0% 孔雀
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