抗(抑)菌试验.docx
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1、 抗(抑)菌试验抗(抑)菌试验2.1.8.1 目的测定抗(抑)菌产品对细菌和真菌的抗(抑)菌作用。常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞 留 抑 菌 效 果 测 定 试 验 、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验, 可视情况选用。2.1.8.2 抑菌环试验2.1.8.2.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度,以显示其抑菌作用。试验 通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗 (抑)菌产品的鉴定。 2.1.8.2.2 试验器材(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 102
2、31) 菌悬液(见 2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。(2)抑菌剂载体 (5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片,经压力蒸汽灭菌处 理后,置 120 烤干 2h,保存备用)。(3)活菌培养计数所需器材(见 2.1.1.3)。(4)微量移液器(5l50l,可调式)。(5)游标卡尺。(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基2.1.8.2.3 操作程序(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂,取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际 使用浓度抑菌剂溶液 20l,然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内,开盖置 温箱(37) 中烤干,或置室温下自然干燥后备用。溶出性抗(抑)菌产品,可
3、直接制成直径为 5mm,厚不超过 4mm 圆片(块), 每 4 片(块) 一组。(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片,每片滴加无菌蒸馏水 20l,干燥后备用。溶出性抗(抑)菌产品的阴性对照样本,应取同种材质不含抑菌成份的样 品,制成与试验组大小相同的样片(块)。(3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为 5105cfu/ml5106cfu/ml 试验菌悬液,在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹 3 次。每涂抹 1 次,平板应 转动 60,最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿,置室温干燥 5min。(4)抑菌剂样片贴放:每次试验贴放 1 个染菌平板,每个平板贴放 4 片试验 样片,1 片阴
4、性对照样片,共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样 片中心之间相距 25mm 以上,与平板的周缘相距 15mm 以上。贴放好后,用无 菌镊子轻压样片,使其紧贴于平板表面。盖好平皿,置 37温箱,培养 16h18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径 (包括贴片) 并记录。试验 重复 3 次。测量抑菌环时,应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。 测量其直径应以 抑菌环外沿为界。2.1.8.2.4 评价规定(1)抑菌作用的判断:抑菌环直径大于 7mm 者,判为有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于 7mm 者,判为无抑菌作用。(2) 3 次重复试验均有抑菌作用结果者,判为合格。(3)阴性对照组
5、应无抑菌环产生。否则试验无效。2.1.8.2.5 注意事项(1)每次试验均应设置阴性对照,不可省略。在报告中亦必须将对照组的结 果列出。(2)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低,接种菌量少,抑菌环常 因之增大; 浓度过高,接种量过多,抑菌环则可减小。(3)应保持琼脂浓度的准确性,否则可影响抑菌环的大小。(4)培养时间不得超过 18h。培养过久,部分细菌可恢复生长,抑菌环变小。(5)抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在 试验当天制备。2.1.8.3 最小抑菌浓度测定试验(琼脂稀释法)2.1.8.3.1 原理本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培
6、养基中,然 后点种细菌,通过细菌的生长与否,确定抗(抑)菌物质抑制受试菌生长的最 低浓度,即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)。本方法 适用于不溶性抗(抑)菌产品。 2.1.8.3.2 试验器材(1)菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ,大肠杆菌 8099 或 ATCC 11229。可根据抑菌剂的用途,选择特定的菌株。(2)水解酪蛋白琼脂培养基(MH),称取 38gMH 琼脂培养基,溶于 1000ml 水 中,加热至沸腾溶解,然后 121高压灭菌 15min,置 4550水浴备用, 此培养基将用于对照试验。(3)0.03mol/L 磷酸
7、盐缓冲液 pH7.2。(4)加样器(1l10l)。(5)4550水浴恒温箱。(6)吸管、试管、平皿。(7)37培养箱。2.1.8.3.3 操作步骤(1)抗(抑)菌溶液的配制:以无菌操作取 5ml 或 5g(固体研磨后)样品, 放入 45ml 灭菌磷酸缓冲液中,充分震荡溶解,配成 10%的均匀分散的溶液或悬 液。(2)含抗菌剂培养基配制:将已配成 10%的抗(抑)菌溶液或悬液用 PBS 做对 倍系列稀释成不同浓度的受试液,置 4550水浴恒温备用。(3)双倍浓度培养基配制:称取 76gMH 琼脂培养基,溶于 1000ml 水中。加热 至沸腾溶解。然后 121压力蒸汽灭菌 15min,置 4550
8、水浴备用。此培 养基将用于稀释抗(抑)菌溶液或悬液。(4)含抗(抑)菌液培养基的配制:分别取 10ml 系列稀释的抗菌液加入平皿 内。将在 4550水浴中的双倍 MH 琼脂培养基 10ml,加入平皿内 ,边加边 摇晃平板,使抗(抑)菌液和培养基充分混匀,待凝固后备用。(5)用加样器取 1l2l(含菌量约为 107cfu/ml)菌悬液点种于含抗(抑) 菌液培养基的平皿,接种后所形成的菌液圈直径约 5mm8mm(每个点菌量约为 104cfu)。(6)以同样方法接种不含抗(抑)菌成分的 MH 琼脂平板,作为阳性对照。(7)将接种后的平板放置 35培养箱中,倒置培养 18h24h,观察结果。2.1.8
9、.3.4 评判规定菌落生长被完全抑制的最低抗(抑)菌液浓度为该样品对受试菌的 MIC。单一 菌落生长可忽略不计。2.1.8.3.5 注意事项(1)接种时,应由低抗(抑)菌剂浓度向高浓度平板依次接种,最后接种对照 平板。(2)为了保证平板受热均匀,培养时平板堆放不得超过 4 个。2.1.8.4 最小抑菌浓度测定试验(营养肉汤稀释法)2.1.8.4.1 原理本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中,然后接种细菌,通 过细菌的生长与否,确定抗(抑)菌剂抑制受试菌生长的最低浓度,即最小抑 菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)。本方法式用于可溶性抑
10、菌 产品。 2.1.8.4.2 试验器材(1)试验菌株:金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ,大肠杆菌 8099 或 ATCC 11229。可根据抑菌剂的用途,选择特定的菌株。(2)营养肉汤培养基,见附录 A。(3)稀释液,见附录 A。(4)吸管、试管 (5)37培养箱。2.1.8.4.3 操作步骤(1)按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液 (2)含抗菌剂培养基配制:将抗(抑)菌溶液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同 浓度的受试液,取各稀释度受试液 2.5ml 加入到含 2.5ml 双倍浓度营养肉汤的 试管中。(3)取 0.1ml 含菌量约为 108cfu/ml 菌悬液接种
11、于含抗(抑)菌剂的营养肉汤 的试管中,作为试验组样本。(4)以同样方法接种不含抗(抑)菌剂的营养肉汤的试管中,作为阳性对照组 样本。(5)取 2 支含营养肉汤的试管中,作为阴性对照组样本。(6)将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置 37培养箱中, 培养 48h,观察结果。(7)试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数,其作用浓度应为 5105cfu/ml5106cfu/ml。2.1.8.4.4 评判规定当阳性对照管有细菌生长(混浊),阴性对照管无菌生长(透明),试验用菌悬液 的作用浓度为 5105cfu/ml5106cfu/ml 时,试验组无菌生长的最高稀释度 所对应的抗(抑)菌剂浓
12、度,为该样品对受试菌的 MIC。2.1.8.4.5 注意事项接种时,应由低抗(抑)菌剂浓度向高浓度依次接种,2.1.8.5 滞 留 抑 菌 效果 试 验2.1.8.5.1 原 理本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下,使用随机 性、双盲的、配对比较的方法检测抗(抑)菌香皂和抗菌沐浴露 12h 或 24h 的 滞留抑菌效果。2.1.8.5.2 试验器材(1) 试验产品: 试验品为 25 套按顺序编号的香皂样品。每套 2 块,一块为测试 样品皂,另一块为不含抑菌剂的对照皂。(2) 不含抑菌剂的洗发水 25 瓶(200ml/瓶)(3) 不含抑菌剂的香皂 25 块(4) 胰蛋白酶大
13、豆肉汤培养基(TSB)(5) 胰蛋白酶大豆琼脂培养基(TSA)(6) 0.075mol/L 的磷酸盐缓冲液(7) 70%酒精(8) 恒温箱(9) 金属筒 (直径 2.2cm、高度 3cm)(10) 一次性接种环(直径 4mm)(11) 小塑料碗(直径 2.2cm,高 2.5mm,)(12) 胶带(Darapore,3M 公司生产) (13) 尼龙刮菌棒(14) Triton-X 100 500ml(15) 外用抗生素软膏(例如:百多邦莫匹罗星软膏)(16) 玻璃弯棒(17) 羊血(18) 金黄色葡萄球菌 ATCC 27217(此株金黄色葡萄球菌是一种低毒性、对青 霉素敏感、对四环素有抗药性的色
14、素株,曾用于许多试验研究,没有任何严重 副作用)。(19) 皮肤消毒剂2.1.8.5.3 试验步骤(1)调整阶段试验开始前 7d 至 14d,受试者使用不含抗(抑)菌成分的香皂、洗发水和 沐浴液进行日常的洗手、洗澡。此阶段持续至少 7d,但不超过 14d。(2)清洗阶段清洗阶段共 3d,受试者每天用抑菌皂清洗一侧前臂,用对照皂清洗另一侧前臂, 清洗过程如下:1)先清洗左臂,用流动水(水温应保持在 3537)打湿前臂内侧;2)用香皂从手腕至臂肘上下摩擦 15s;3)用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫 45s;4)用流动的清水冲洗前臂 15s,不要搓擦;5)用纸巾沾干前臂. 不要搓擦;6)重复以上
15、步骤清洗右臂;7)按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂 3 次,每次间隔至少一个小时,在最 后一次清洗之后,需记录好时间,在 12h 之后,进行滞留效果检测。在第 9 次 清洗前臂以后,受试者不能洗澡、淋浴或洗净前臂,直到试验结束。用品包的 标签上注明洗哪只手臂。清洗前后的两块香皂的重量及受试者完成清洗的情况, 须记录下来。(3)试验阶段清洗阶段的第四天(最后一次清洗后 12h 或 24h),将在受试者每只前臂上划出 一个试验区,对试验区进行接种、封包和回收存活细菌,具体步骤如下:1)将金黄色葡萄球菌(ATCC 27217)连续转种 3 代,取第 3 代培养物接种于胰 蛋白大豆肉汤培养基(TSB
16、)中,在 352的条件下培养 20h 2h。然后用 胰蛋白酶大豆肉汤适当稀释菌悬液,使菌悬液浓度约为 108cfu/ml109cfu/ml。2)细菌接种: 在受试者的每只前臂中间部位(不要在手腕和肘皱褶处),用带 有印墨直径为 3.0cm 的玻璃量筒扣在皮肤上,划分出一个试验区。使用加样器 取 10l 上述菌悬液,接种于前臂试验区(菌落数为 106cfu/试验区107cfu/ 试验区),用一次性接种环,把接种物涂成一圆形,使其与试验区边缘应有 4mm5mm 的距离。3)封包:细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面 ,再用胶带将小塑料碗固 定在皮肤上,记录封包的时间。4)回收存活细菌:接种后 2
17、h5min 对前臂上接种的区域进行取样。将金属筒 放置于试验区中间部位,不要接触到盖有印墨的边缘。将 1ml 含 0.1% triton- X100 的 0.075mol/L 磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内,用尼龙刮菌棒刮洗金属筒 罩住区域内的皮肤 60s,将筒内液体吸移至试管内,再加 1ml 含 0.1%triton X-100 的 0.075mol/L 磷酸盐缓冲液,对该区域内的皮肤进行第 2 次刮洗 30s,将 第 2 次擦洗的液体,注入含第 1 次刮洗液体的试管中。5)实验区试验后的消毒处理: 一个实验区采样之后,需用 70%的酒精对实验区 进行消毒。然后对另一个实验区以同样方法进行采样,
18、采样结束后,先用 70% 的酒精对实验区进行消毒,然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理,处理 后清水冲洗,擦干,再涂少量的抗生素软膏。6)平皿接种与培养:对每一个取样进行平皿接种,以 0.0375mol/L 磷酸盐缓冲 液对样品进行 10 倍系列稀释,选适当稀释度取 0.1ml 接种于 2 个含 5%羊血的 TSA 平板表面,用玻璃弯棒涂匀,在 352的培养箱中培养 48h 4h,计 数菌落数。7)抑菌率的计算抑菌率= (对照平均菌落数试验平均菌落数)/ 对照平均菌落数 100%2.1.8.5.4 判定标准试验不得少于 16 人次,抑菌率50%,可判定该产品在规定的时间内有滞留抑 菌作用。2
19、.1.8.5.5 注意事项(1)受试者录用标准年龄介于 18 岁至 65 岁的男性或女性;受试者应身体健康;前臂应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题;同意在整个试验期间,避免使用抗(抑)菌洗液和乳膏、局部类固醇类药和 全身或局部使用抗生素,除非因为并发病症医生要求使用;同意在清洗阶段使用非药物香皂或洗液洗澡和淋浴,但受试者不能清洗前臂。 在第 9 次洗完前臂以后,不洗澡,淋浴或洗净前臂,直到试验结束。(2)排除受试者的标准 如果受试者有下列情况之一,不能被录用参加试验 同时参加另外一个临床试验 在过去的 14d 中,参加过任何一种形式的关于清洁手或手臂的试验 对香皂、去污剂、香水或青霉素过敏
20、怀孕妇女 诊断患有糖尿病、肝炎、艾滋病(HIV 阳性)、器官移植者,(3)其它试验限制 受试者不得使用其它清洁用品; 受试者应避免洗热水盆浴和游泳; 受试者应避免接触未干的油漆、涂料或者其它溶剂; 受试者应避免在手腕处和前臂上喷洒香水。(4)在试验完成后的 48h72h 内,需检查前臂上有无小脓疱、水疱,隆起的 红色痒疱。出现这些情况的受试者应尽快通知检验单位。2.1.8.6 洗衣粉抗(抑)菌效果鉴定方法 82.1.8.6.1 原 理本 方 法 通过 模 拟 洗 衣 机 的 洗 衣 过 程 ,检 测 抗 (抑)菌 洗 衣 粉(剂)的 抗 菌 作 用 。 2.1.8.6.2 试 验 器 材 (1
21、) 试 验 菌 株大 肠 杆 菌 A T C C 1 1 2 2 9,金 黄 色 葡 萄 球 菌 A T C C 6 5 3 8。(2)培 养 基 营 养 琼 脂( 琼 脂 含 量 为 1.5%)营养琼脂 A:在营养琼脂中另加入 1.5 %的琼脂。TSA 营养肉汤。(3)牛 血 清 白 蛋 白( 过 滤 除 菌)(4)烷 基 酚 聚 氧 乙 烯 醚 (Tergitol )(5)碳 酸 钠 (6)标准 硬 水(7)非 离 子 浸 湿 剂 : 见 测 试 棉布 制 备 部 分(8)冲 洗 溶 液 (9) 中 和 剂( 经 中 和 剂 鉴 定 试 验 合 格 )(10) 吐 温 80 ( 过 滤 除
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