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1、1实验一 细胞形态大小观察一、实验目的:学习测微尺的使用,并测量洋葱内表皮细胞的大小。二、实验原理:使用镜台测微尺 ,目镜测微尺(直线式、网格式)和微调焦轮上的标尺测量细胞的大小。三、实验用品:2.5% 番红溶液;洋葱上皮细胞;草履虫、洋葱根尖及其它细胞永久切片。四、实验步骤:(一)目微尺的校对:将目微尺放入目镜、台微尺卡在载物台上,调焦,看清台微尺,台微尺和目微尺左、右各选一重合线。并根据下面公式计算:载玻片大小的台微尺 载物台 台、目微尺在视野内平行圆的目微尺目镜筒(10,40,100)台、目微尺各选一重合线,读取这一范围内的格数目微尺每格大小X10、 40、 100 = a a n :台
2、微尺刻度数m :目微尺刻度数 移去台微a ::台微尺实际值(0.01mm)尺,换上洋葱内表皮标本(二)观察细胞形态,测量细胞大小:1、观察洋葱表皮 cell(取其内表皮放在载玻片上,加番红染 5 分钟封片观察)(1)测量细胞横截面面积撕取洋葱内表皮 0.30.3cm 放于载玻片 番红染液染色 5min 加盖玻片(用滤纸条吸去多余的液体) 10物镜下观察 粗调焦轮找到细胞 微调焦轮调节清晰,看到细胞 旋转目镜将标尺与细胞长边平行,2并记录格数 a 旋转目镜将标尺与细胞宽边平行,记录格数 b 细胞截面面积=axbx(x 实际数值前面已经校对)(2)测量细胞厚度:调节微调焦轮 两细胞之间变成细,黄亮
3、色线,细胞表面柱状杂质(上表皮) 记录微调焦论刻度 调节微调焦轮 两细胞之间黄亮线逐渐变粗,变黑,变成黑色细线,细胞表面杂质(下表皮) 记录微调焦轮刻度 两次记录之间焦轮刻度数 c 细胞厚度=c2m(微调焦轮刻度数 2m/格)(3)测量细胞核体积调节微调焦轮 细胞核清晰 调节目微尺测量细胞核 根据球的体积计算细胞核的体积 Vn2、计算细胞体积,求 NPNP= 100% (NP核质比)V长方体=abc V椭圆形= 4ab2/3 (a长半径 b短半径 c细胞高)V球=4R3/3 V圆柱形=r2h (r半径 h高)3、其它细胞永久片的观察。五、实验结果:1、求洋葱细胞的 NP。2、画出洋葱表皮细胞。
4、3、其它细胞永久片的细胞形态图。3实验二 观察胞间连丝的形态一、实验目的观察植物细胞间的胞间连丝,认识细胞不是“独立王国”,每个细胞与其周围细胞有千丝万缕联系。二、实验原理除极少数特化的细胞外,高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接,完成细胞间的通讯联络。 三、实验材料红辣椒。四、实验步骤:红辣椒表皮细胞临时制片:剪取一小块红辣椒放在载玻片上用手按住一边用刀片小心刮去果肉留下一层极薄(几乎透明)的表皮用刀片切下刮去果肉的表皮(大小约 0.3cm0.3cm)置于一干净载玻片上加水一滴盖片用滤纸条吸去多余的水观察(10,40) 五、实验结果:画出胞间连丝图,说明胞间连丝作用。4实验三 液泡系、线粒体
5、的活体染色一、实验目的及意义:学习活体染色的方法和原理。二、实验原理:1、活体染色;用某些无毒或毒性较小的染色剂显示出细胞内某些天然构造的真实性,而不影响细胞的生命活力,也不产生任何的物理、化学变化引起细胞死亡,这种染色方法叫活体染色。2、液泡系、线粒体是细胞内重要的细胞器,它们通过特殊的活体染色剂染色,可显示出生活状态下的形态结构。3、染料:酸性:带负电荷,易在细胞质中产生沉淀。 (种类很少)碱性;带正电荷,被普遍采用。中性红染液:是液泡系特殊的活体染色剂,可将不同发育时期的液泡染成不同深度的红色,而细胞质、细胞核不被染色。 (黄豆芽)Janus Green B 染液:是对线粒体具有专一性的
6、染料,具脂溶性,解离后,有染色能力的基团带正电,结合在带负电的线粒体内膜上。由于线粒体内膜上细胞色素氧化酶系的作用,使染料保持氧化状态而显蓝绿色其它部分不染色。三、实验步骤:1:液泡系的观察:取豆芽根尖 12cm 用双面刀先纵切一小部分再沿切面长纵切根尖切下极薄一片,尽量是一层细胞放在载玻片上滴中性红溶液染色 10-15 分钟吸水纸吸去染液滴加蒸馏水加盖玻片吸水纸吸去多余的水份观察液泡大小及颜色变化(10,40)在分生组织区细胞没有液泡,随着细胞的生长成熟,较大细胞中液泡小而圆、染色浓、数量多个,而成熟细胞中液泡发展成为一个中央大液泡、颜色浅,表现为几乎整个细胞被染色。2:线粒体分布的观察(1
7、)植物细胞中线粒体分布:用镊子撕洋葱内表皮(0.30.3cm)置于载玻片上滴一滴 Janus Green B染色 30 分钟滴加蒸馏水吸水纸吸干盖片观察10观察40观察5载玻片上滴加松柏油 100观察。(2)动物细胞中线粒体分布,取小鼠肝脏放在表面皿用 Ringer 液冲洗多次,冲洗掉血水用镊子分成 4 份,分别放在 4 个表面皿里继续将分到的肝脏用 Ringer 液冲洗多次,冲洗掉血水用滤纸条吸去多余的液体用镊子撕成小块(约大米粒大小) (撕扯中有单个细胞掉下来)用 Janus Green B 染色,染液不能完全浸没染色 30 分钟,不停翻动组织块,以利于呼吸及时补充表面皿里的水份,防止水份
8、蒸发导致细胞悬液过浓。用吸管吸组织液(染色液)观察加盖玻片时(加 2 根头发)10观察40观察在载玻片上滴加松柏油,100观察(观察后用镜头纸沾二甲苯擦掉镜头及玻片上的松柏油)四、作业:1、绘图豆芽根尖液泡系的分布(100) 。2、绘图洋葱线粒体的分布(100) 。3、绘图鼠肝细胞线粒体的分布(100) 。6实验四 叶绿体的分离与观察一、实验目的1. 通过植物细胞叶绿体的分离,了解差速离心分离细胞器的一般原理和方法。2. 观察叶绿体的形态。二、实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法。依次增加离心力和离心时间,就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉
9、降在离心管底部,分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35molL 氯化钠或 0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在 1 000r/min 的条件下离心 2min,以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后,在 3 000r/min 的条件下离心 5min,即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。三、实验用品1、器材主要设备:普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。小型器材:烧杯 2 个,10ml 量筒,滴管,离心管,纱布若干,载片及盖片。 2、材料:新鲜菠菜。3、试剂:0.35mol/L NaCl 溶液。 四、实验
10、方法1、叶绿体的分离与观察(1)选取新鲜的嫩菠菜叶,洗净擦干后去除叶梗及粗脉,称 6g 于研钵中,加10ml 0.35mol/L NaCl 溶液,用研钵捣碎成匀浆状。(2)将匀浆用 4 层纱布过滤于 50ml 烧杯中。(3)取滤液 4ml 于离心管中,在 1000r/min 下离心 2min(注意离心前用天平配平) 。(4)将上清液倒入另一个干净的离心管中。(5)将上清液在 3000r/min 下离心 5min。弃去上清液,沉淀即为叶绿体(可能混有部分细胞核),(6)将沉淀用 2 ml 0.35mol/L NaCl 溶液悬浮(用滴管吹打沉淀使之悬浮) 。(7)用滴管取叶绿体悬液一滴滴于载片上,
11、加盖片后(用滤纸吸掉多余的液体)即可在普通光镜下观察(10,40,100) 。(8)叶绿体悬液如果过浓,用 0.35mol/L NaCl 溶液稀释后重新制片观察。2、菠菜叶切片观察用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上,滴加 12 滴70.35molL NaCl 溶液,盖片后轻压,置普通显微镜下观察。五、实验结果1、画出高倍镜下的叶绿体图(多角度) ;2、说明 0.35mol/LNaCl 溶液的作用,是否可以蒸馏水代替。实验五 掌握植物细胞骨架(微丝)的观察方法一、实验目的:光镜下观察细胞骨架。二、实验原理:1、原理:在一定时间内,用适当浓度的 TritonX-100(曲拉通 X-100
12、)处理时,可将细胞内蛋白质破坏,但细胞骨架系统的蛋白质却被保存,后者用考马斯亮蓝R250染色,可在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。2、细胞骨架:指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。在细胞中支持和连接细胞各组份,与细胞运动有关的结构,包括微丝(MF) 、微管(MT) 、中间纤维。3、TritonX-100:非离子型去垢剂,在一定时间内可消除细胞骨架外部杂蛋白,而骨架蛋白得以保留但长时间作用,也会破坏骨架蛋白。4、M-缓冲液:增加膜稳定性,冲洗 TritonX-100。5、戊二醛:固定剂,使骨架蛋白变性,但网络形态不变。6、考马斯亮兰 R250:蛋白质染色剂(无选择特异性) 。三、试剂材料:M-缓冲液
13、 6mMol/L pH6.8;1% Triton X-100 溶液 ; 2.5%戊二醛;0.2%的考马斯亮兰 R250;PBS 溶液;洋葱。四、实验方法:1.撕洋葱内表皮,置 PBS 液中,使之沉降 3-4 小时;2.用镊子取几片处理好的洋葱内表皮,置于表面皿中;3.用滤纸吸去 PBS 液,加入 1%Triton x-100 浸没,经常翻动洋葱内表皮。 (处理时间 15,17,19,21,23 分钟)处理时每人选一个时间,处理结束后倒掉1%Triton x-100,用滤纸吸去多余液体。4.加入适量的(达到完全浸泡)M-缓冲液,浸泡 3-5 分钟,倒掉液体。重复 3次;5.用滤纸吸去多余液体;6
14、.加入 2.5%戊二醛浸泡 0.5 小时(轻轻翻动 2 次) ;7.倒掉液体。用滤纸吸去多余液体;8. 加入适量的(达到完全浸泡)PBS 缓冲液,浸泡 3-5 分钟,倒掉液体。重复3 次;9.用滤纸吸去多余液体;10.加入适量的(达到完全浸泡)0.2%考马斯蓝染色液,染 20 分钟;11.倒掉染色液。用滤纸吸去多余液体;12.加入适量的(达到完全浸泡)蒸馏水,浸泡 0.5 分钟,倒掉液体。重复 2 次;812.用镊子撕洋葱内表皮(大小约 0.30.3cm) ,放在载玻片上,加盖片,在普通光镜下观察(10,40)五、实验结果:1、 绘出实验观察到的细胞骨架图;2、 说明细胞骨架的作用;实验六 细
15、胞活力的测定一、实验目的:学习鉴别细胞活力的方法。二、实验材料及试剂1、口腔上皮细胞,鼠肝细胞。2、0.01%吖啶橙生理盐水溶液,0.05%苯胺黑生理盐水液三、实验内容:1、细胞活力鉴别:用牙签取口腔上皮细胞,涂于载玻片上,用 0.01%吖啶橙染色,兰光激发,观察细胞活性与荧光强弱的关系。3、 细胞死活鉴别:取鼠肝细胞悬液,滴一滴在载玻片上,加一滴苯胺黑染 1-2 分钟,在普通光学显微镜下观察。四、实验结果:记录实验现象并解释。注:鼠肝悬液:头天取鼠肝用 70%乙醇固定,冰箱保存,为死细胞,实验前取新鲜鼠肝、悬浮,为活细胞。观察物中死活细胞均有,用生理盐水悬浮。1:细胞活力鉴别 实验步骤:用牙
16、签取口腔上皮细胞,涂于载玻片上,0.01%吖啶橙染色约 5 分钟,兰光激发观察细胞活性与荧光强弱的关系。2:细胞死活鉴别实验步骤:取小鼠肝细胞悬液,滴一滴在载玻片上,加一滴苯胺黑染 1-2 分钟,观察。9实验七 荧光的细胞化学测定一、实验目的:了解荧光显微技术的原理和方法,以及在细胞化学方面的应用。二、实验原理:1、荧光:当一种波长的光照射某种物质时,这种物质会在极短的时间内发出较入射光波长更长的可见光,这种被激发出的可见光叫做荧光。自发荧光:有些生物体受到短波光照射后直接发出荧光;次生荧光:生物材料吸附荧光染料后,经短波光照射发出荧光;2、荧光显微技术:用短波光照射被检物使其发出荧光,然后在
17、荧光显微镜下镜检,观察荧光强弱,颜色分布,从而测定细胞活性,荧光物质的分布及某种结构的有无。三、实验用品:0.01% 吖啶橙生理盐水液(DNA 专一染料) 。0.02%异硫氰酯荧光素(激发光源:蓝色发绿光) 。0.01%罗丹明生理盐水液(不是线粒体专一性染料,所以整个细胞都能被染色,而线粒体呈亮红色) 。四、实验内容:1、DNA 分布(核)的观察:撕掉洋葱内表皮,吖啶橙(DNA 专-性染料)染色 5 分钟,生理盐水冲洗,蓝光激发观察(冲洗方法:盐水一滴,吸掉,再一滴,观察)2、蛋白质分布(细胞)的观察:撕掉洋葱内表皮,异硫氰酯荧光素染 5 分钟,盐水一滴,吸掉,再一滴,观察,生理盐水冲洗,蓝光激发。3、线粒体,细胞骨架观察:撕洋葱内表皮,罗丹明溶液染 5 分钟,冲洗,绿光激发(整个细胞红色,靠细胞壁处有小红点为线粒体) 。10五、实验结果:分别说明实验结果(物质、结构、颜色及分布) 。1、 DNA 分布观察:核呈亮绿色,其间可见相间的亮区或条纹呈亮绿色,细胞中也有较亮的绿色条纹。2、 蛋白质分布观察:液泡处暗,胞质部为亮绿色。3、 线粒体的分布:整个视眼显红色,能观察出细胞的形态,红亮晶晶的红色小点。
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