2022年改善缺铁性贫血功能评价方法技术转让网.docx
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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 改善缺铁性贫血功能评判方法试验工程、试验原就及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验工程1.1 动物试验 1.1.1 体重 1.1.2 血红蛋白 1.1.3 红细胞比积 /红细胞游离原卟啉 1.2 人体试食试验 1.2.1 血红蛋白 1.2.2 血清铁蛋白 1.2.3 红细胞游离原卟啉 /红细胞运铁蛋白饱和度2 试验原就2.1 动物试验和人体试食试验所列指标均为必做工程;2.2 针对儿童的人体试食试验,只测血红蛋白和红细胞内游离原卟啉;2.3 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安
2、全性作进一步的观看;3 结果判定3.1 动物试验:血红蛋白指标阳性,红细胞游离原卟啉/红细胞压积二项指标一项指标阳性,可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物试验结果为阳性;3.2 人体试食试验 3.2.1 针对改善儿童缺铁性贫血功能的,血红蛋白和红细胞内游离原卟啉二项指标阳性,可 判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用;3.2.2 针对改善成人缺铁性贫血功能的,血红蛋白指标阳性,血清铁蛋白、红细胞内游离原 卟啉 /血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性,可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用;改善缺铁性贫血功能检验方法 Method for the Assessment of Impro
3、ving Nutritional Anaemia Function 1.动物试验1.1 原理用低铁饲料喂饲动物可形成试验性缺铁性贫血模型,再赐予受试样品,观看其对血液名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 14 页精选学习资料 - - - - - - - - - 细胞学、血液生化学等指标的影响,可判定该受试样品对改善动物缺铁性贫血的作用;1.2 试验动物健康初断乳大鼠,单一性别,每组大鼠 812只;1.3 低铁饲料配方:成分玉M 淀粉添加量g/kg 529.5 蛋清蛋白 * 200.0 蔗糖100.0 玉M 油(无添加剂)70.0 纤维素50.0 混合矿物盐 AIN-93G-M
4、X 35.0 10.0 混合维生素 AIN-93G-VX L-胱氨酸3.0 2.5 氯化胆碱* 亦可使用 EDTA 处理的酪蛋白AIN-93G 混合矿物盐配方矿物质Calcium carbonate anhydrous Potassium phosphate monobasic Potassium citrate, tripotassiummonohydrate Sodium chloride Potassium sulfate Magnesium oxide Zinc carbonate Sodium meta-silicater9H 2O Manganous carbonate Cupri
5、c carbonate 添加量g or mg/kg mix 357.00 196.00 70.78 74.00 46.60 24.00 1.65 1.45 0.63 0.30 0.275 81.50 63.50 31.80 17.40 10.25 添加量Chromium potassium sulfater12H2O Boric acid 17.5% B, mg Sodium fluoride 45.24% F, mg Nickel carbonate 45% Ni, mg Lithium chloride 16.38% Li, mg Sodium selenate anhydrous41.7
6、9% Se, mg AIN-93G 混合维生素配方维生素g/kgmix 名师归纳总结 Nicotinic acid 3.000 第 2 页,共 14 页Ca pantothenate 1.600 Pyridoxine-HCl 0.700 Thiamin-HCl 0.600 Riboflavin 0.600 Folic acid 0.200 - - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - Biotin Vitamin B-12 cyanocobalamin 0.1% in mannitol Vitamin E all-rac-a-tocopheryl acetate2
7、 500 IU/g Vitamin A all-trans-retinyl palmitate2 500,000 IU/g Vitamin D-3 cholecalciferol 400,000 IU/g Vitamin K-1 phylloquinone Powdered sucrose 0.020 2.500 15.000 0.800 0.250 0.075 974.655 1.4 剂量分组及受试样品赐予时间试验设三个剂量组和一个低铁对比组,以人体举荐量的5 倍为其中的一个剂量组,另设二个剂量组,必要时设阳性对比组(硫酸亚铁或乳酸亚铁,剂量为 2ppm 或 2mg/kgbw,以 Fe元素计
8、);受试样品赐予时间 30 天,必要时可延长至 45 天;1.5 试验步骤1.5.1 建立缺铁性贫血大鼠模型选用健康断乳大鼠在试验环境下适应35 天后饲予低铁饲料及去离子水(或双蒸水),采纳不锈钢笼及食罐,同时,采纳剪尾取血法放血,5 天一次,每次 0.30.5ml;实验过程中防止铁污染;自第 3 周开头每周选取部分大鼠采尾血测 Hb,如多数动物 Hb 低于100g/L 时,测定全部大鼠的体重及 Hb;1.5.2 复原试验选取 Hb100g/L 的大鼠作为试验动物,依据贫血大鼠Hb 水平和体重将其随机分为低铁对比组和三个试验组,各组均连续饲予低铁饲料,低铁对比组赐予相应溶剂,试验组分别赐予不同
9、剂量的受试样品,受试样品赐予时间30 天,必要时可延长至45 天,测定体重及各项血液学指标;1.6 观看指标体重、血红蛋白、红细胞比积 /红细胞内游离原卟啉1.6.1 血红蛋白测定(氰化高铁法)消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白;1.6.1.1 吸光系数法1.6.1.1.1 原理血红蛋白( haemoglobin,Hb )被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白,再与氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白(红色),氰化高铁血红蛋白(红色)极为稳固,在 540nm 波长下,摩尔吸光系数为 44000,据此,用分光光度法测其光密度,运用吸光系数作血红蛋白的定量测定;1.6.1.1.2 仪器名师归纳总结 -
10、 - - - - - -第 3 页,共 14 页精选学习资料 - - - - - - - - - 分光光度计;10 微升微量吸管;1.6.1.1.3 试剂 称取碳酸氢钠(NaHCO 3,AR )140 毫克、铁氰化钾 200 毫克、氰化钾 50 毫克,用水 4)储存,至少可稳固 溶解并稀释到 1000 毫升;贮存於棕色试剂瓶内,在暗处或冰箱(数月到 1 年;1.6.1.1.4 试验步骤1.6.1.1.4.1 取试剂 2.5毫升於 5毫升带盖试管中,加入10微升血液,混匀后,放置15分钟;1.6.1.1.4.2 选用 0.5厘M 光径比色杯,于540nm波长下,以试剂调零点,将所得样品管之光密度
11、乘以 736,即为血红蛋白浓度(g/L);运算公式如下:Ct= 44000 DHiCN 2 510 . 5 64458D HiCN 540 736 540Ct=待测的血红蛋白(g/L )浓度;540D HiC N = 氰化高铁血红蛋白在 540nm波长下测出的光密度;251= 测定时血液的稀释倍数(血10 L加入试剂 2.5mL 中)44000= 氰化高铁血红蛋白的摩尔吸光系数 0.5= 比色杯的光径 64458= 血红蛋白的分子量 1.6.1.1.5 留意事项 1.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内,以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低;1.6.1.1.5.2 仪器因摩尔吸光系数法完
12、全依靠仪器的吸光度来运算,故此法要求所用的仪器性 能要符合要求(如仪器的波长精确与否,以及灵敏度及线性等),否就将直接影响测定的 结果;1.6.1.1.5.3 仪器在使用前最好应以WHO 规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用;参考液最好选用ICSH (国际血液学标准化委员会)确定的由RIV (荷兰国立公共卫生讨论院)制作的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氰化高铁血红蛋白标准液;1.6.1.2 标准曲线法1.6.1.2.1 原理 血红蛋白( hemoglobin ,Hb)在铁氰化钾和氰化钾的作用下生成极为稳固的氰化高铁 血红蛋白(红色),其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比;用分光光
13、度计在 540nm 波长 下,测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度,制成标准曲线,测得待测样品的吸光 度后查标准曲线即可得 Hb 的浓度;1.6.1.2.2 仪器 10 L血色素吸管(或定量毛细管)5mL 或 10mL 带盖试管 分光光度计名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 14 页精选学习资料 - - - - - - - - - 1.6.1.2.3 试剂称取碳酸氢钠(NaHCO 3,AR )140mg、铁氰化钾 200mg、氰化钾 50mg,用蒸馏水溶解并稀释到 1000mL ,贮存于棕色试剂瓶内,储存于 4冰箱可稳固至 1 年;1.6.1.2.4 试验步骤吸取 2.
14、5mL 试剂于 5mL 带盖试管中,用10 L 血色素吸管(或定量毛细管)取大鼠尾血或静脉血10 L放置于已放入试剂的试管中;混匀放置15min ;选用 0.5cm 光径比色杯,于 540nm 波长下,以试剂调剂仪器零点,测定各样品管的吸光度,同时测定血红蛋白标准 和参考标准物质的吸光度,绘制血红蛋白的标准曲线;查标准曲线可求得待测样品和参考 标准物质的血红蛋白含量 g/L ,运算参考物质的回收率;1.6.1.2.5 留意事项 1.6.1.2.5.1 不要将试剂放在聚乙烯瓶内,以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低;1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系数方法运算血红蛋白的含量,由于仪器的波
15、长精确与否仪器 的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果;1.6.1.2.5.3 每次测定时,在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质(低、中、高 3个浓度);1.6.1.3 数据处理及结果判定试验数据可用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,运算F 值, F 值 F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F 值 F0.05,P 0.05,用多个试验组和一个对比组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变 量转换,待满意正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;如变量转换后仍未达到 正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计;结果判定 受试样品组
16、与对比组比较,血红蛋白浓度上升经统计处理差异有显著性,且受试样品 组前后上升幅度平均达到 10g/L 以上,判定该试验结果阳性;1.6.2 红细胞内游离原卟啉测定1.6.2.1 原理 血红蛋白的合成过程中,幼红细胞中的原卟啉在血红素合成酶的作用下与铁结合,当 铁供应不足时,红细胞内的原卟啉乃以游离形式累积起来超过正常水平;因此,检测红细 胞内游离原卟啉(Free erythrocyte proloporphyrin , FEP)的含量是检查缺铁性红细胞生成 的有效方法;血液样品经生理盐水稀释后,分别以乙酸乙酯:乙酸混合液(4:1)和 0.5N盐酸提取分离血中游离原卟啉,在肯定波长下测定其原卟啉
17、的荧光强度而定量;1.6.2.2 仪器 1.6.2.2.1 荧光分光光度计或 930型荧光光度计;1.6.2.2.2 离心机;1.6.2.2.3 混旋器;名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 14 页精选学习资料 - - - - - - - - - 1.6.2.3 试剂1.6.2.3.1 肝素抗凝剂一支12500 单位的肝素以0.9% 生理盐水稀释至25mL ( 1mL=500 单位);1.6.2.3.2 5%(W/V)硅藻土生理盐水悬浊液称取 5g硅藻土加 0.9%生理盐水至 100mL;1.6.2.3.3 4:1乙酸乙酯和乙酸混合液;1.6.2.3.4 0.5N HCl
18、;1.6.2.3.5 原卟啉标准液;1.6.2.3.5.1 原卟啉标准贮备液(1.5N HCl 稀释至 100mL;50mg/L):称取 5mg原卟啉,加 4mL无水乙醇使之溶解,以1.6.2.3.5.2 原卟啉标准中间液(1.0mg/L):取 2mL原卟啉贮备液,以乙酸乙酯与乙酸(4:1)混合液稀释到 100mL;1.6.2.3.5.3 原卟啉标准应用液(0.1mg/L):取 1mL原卟啉中间液,以乙酸乙酯与乙酸(4:1)混合液稀释到 10mL;1.6.2.4 试验步骤试剂样品管空白管标准管肝素( mL) 0.10 0.10 0.10 全血( mL) 0.02 水 (mL) 0.02 0.0
19、2 5%硅藻土悬浊液(mL )0.15 0.15 0.15 原卟啉标准应用液(mL) 0.5 乙酸乙酯与乙酸( 4:1)混合液( mL) 4 4 3.5 注:按上表依次加入各种试剂,在加入乙酸乙酯与乙酸混合液前,用混旋器混合已加入的混合液,然后边混合边加入乙酸乙酯与乙酸混合液;离心 15分钟,将各管上清液分别倒入10mL 比色管中,每管加4mL 0.5N盐酸,振摇 5分钟静止使之分层,将上层溶剂抽出弃去,测定盐酸液的荧光强度(1.6.2.5 荧光测量30分钟内比色);1.6.2.5.1 如使用日立 MPF-4 型荧光分光光度计测定条件为激发波长为 403nm,狭缝 10nm;发射波长为 605
20、nm,狭缝为 5nm,液槽为 1cm厚石英槽;1.6.2.5.2 如使用国产 930型荧光光度计测试,条件为激发滤光片420,荧光滤片 550,灵敏度1 500,满度开关开至最大,液槽为1cm厚石英槽,检出灵敏度为0.01g/4mL;在不同量原卟啉( 0g,0.01g,0.03g,0.05g,0.07g,0.1g)呈线性关系;1.6.2.6 运算样品荧光强度空白荧光强度100 标准管原卟啉含量(g) 10血中原卟啉含量(g/L全血) = 标准管荧光强度空白荧光强度样品取样量 mL1.6.2.7 数据处理及结果判定试验数据可用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,运算F 值,
21、 F 值 F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F 值 F0.05,P 0.05,用多个试验组名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 14 页精选学习资料 - - - - - - - - - 和一个对比组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满意正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;如变量转换后仍未达到 正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计;结果判定 受试样品组与对比组比较,红细胞内游离原卟啉降低经统计处理差异有显著性,即可 判定该试验结果阳性;1.6.2.8 留意事项 1.6.2.8.1 荧光强度随时间延长而逐步衰退,但 3
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