外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录ppt课件.pptx
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1、外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录实验内容人外周血单个核细胞总人外周血单个核细胞总RNA 的分离的分离和纯化。和纯化。逆转录聚合酶链反应(逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。)。外周血单个核细胞分离的原理人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴细胞淋巴细胞和单核细单核细胞胞。 单核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同,因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺( ficoll-hypaque )分离液作密度梯度离心,离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。外周血单个核细胞
2、的分离实验步骤1.吸取2ml淋巴细胞分离液加入5ml塑料试管;2.取抗凝血1ml,用1ml生理盐水稀释混匀,然后沿管壁缓慢加入加入到到淋巴分离液(上层为抗凝血,下层为淋巴细胞分离液);3. 2500rpm,离心15min(沉降系数不同,而分离出单核细胞);4. 吸弃最上层血浆,再吸取单核细胞层至一新的5ml塑料试管中,加生理盐水至管口1cm处,混匀后离心,2500rpm,5min;5.吸弃上清,加生理盐水500ml轻柔吹打混匀后,转入1.5ml Ep管中,2500rpm,5min;6.吸弃上清,留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。酸性酚法抽提RNA的原理苯酚在酸性条件下既可溶解DNA,
3、又是蛋白变性剂,联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离,最后利用异丙醇沉淀核酸,获的纯化的总RNA。RNA极易降解,因其RNA酶分布广、活性强、且难以失活,痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解,实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性,减少RNA的降解。 1. 焦磷酸二乙酯(DEPC),一种强烈的烷化剂,能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶。 2. 异硫氰酸胍,一种强蛋白变性剂,可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失,抑制外源性RNA酶活性。抑制RNA酶活性的试剂注意事项预防RNase污染1. 人的唾液中含有大量RNase,皮肤中含有RNase和细菌,而霉菌有可能成
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