最新受体配体结合研究ppt课件.ppt
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1、构型(configuration)和构象(conformation)nConfiguration:The geometrical arrangement in polymers arising from the order of atoms determined by chemical bonds.nConformation:The geometrical arrangement in polymers arising from rotation about adjacent carbon-carbon single bonds.n构型的改变,分子中一定会有共价键的断裂和新的共价键的生成;而构
2、象的改变不需要共价键的变换3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达n设:RT为受体的初始浓度 n (2)n重排并整理得:n (3)n上式即Scatchard方程 ,以RL/L为纵轴,以RL为横轴作图得一直线n直线斜率为-1/Kd, 横轴截距为RT, 纵轴截距为RT/KdRLRTRRLLRLRTRLLRKd1RLKKRTKRLRTLRLddd Scatchard图3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达n同理可推出:n (4)n上式为Woolf方程:以L/RL为纵轴,以L为横轴作图得一直线n直线的斜率为1/RT, 横轴截距为-1/Kd, 纵轴截距为Kd/RT1LRTRTKRLLd Woolf
3、图3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达n同理还可推出:n (5)n上式为Lineweaver-Burk方程,亦称双倒数方程:以1/RL为纵轴,以1/L为横轴作图得一直线n直线的斜率为Kd/RT, 横轴截距为1/Kd, 纵轴截距为1/RT111LRTKRTRLd Lineweaver-Burk图3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达n设:LT是总配基浓度, L = LT RL, 将 L = LT RL 和 R = RT RL代入(2)式,经整理得:n (6)n上式为以RL为变量的双曲线一元二次方程n当RT、Kd固定时,RL随LT的变化而变化,开始上升很快,以后逐渐趋向水平,这就是饱和曲
4、线02LTRTKLTRTRLRLd受体与配基结合曲线nSB为特异性结合,NSB为非特异性结合,TB为总结合nSB= TB NSB3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达n将(1)式重排变成下式:n (7) n设RL = RT, L=L1/2, 带入上式,得n整理,得 Kd = L1/2n结论:在50受体结合配基时,体系中游离配基的浓度就是受体的解离平衡常数Kd值 LKLRTRLd212121LKLRTRTd3.2 双位点系统n一种配基可以和两种受体结合,这两种受体往往是某类受体的两种亚型n选用某种放射配基,进行饱和实验, 用Scatchard 作图法得到的不是直线而是向上凹的曲线;这条曲线是
5、由高低亲和性不同的两条直线加合成的双位点系统饱和曲线饱和曲线Scatchard曲线曲线 双位点系统n 近年来发展了很多方法用来进行双位点系统受体亚型的研究n用选择性放射配基进行多点饱和实验n用非选择性放射配基和选择性非放射配基进行竞争性取代实验n 原则上它们也可以用于多种亚型的分析,但是由于配基选择性的限制及实验误差的存在等原因, 多数成功的例子仅限于双位点系统3.2.1选择性放射配基的饱和曲线n 选择性放射配基,对一种亚型有高亲和力, 而对另一种亚型则为低亲和力n 多点饱和实验显示,随着LT加大,RL先是因高亲和力的大部分结合趋向饱和,然后由于低亲和力亚型结合增多,曲线又住上翘n 用Scat
6、chard作图得到的不是直线而是向上凹的曲线,也就是说,随着LT增加,曲线前部分斜率很陡 (高亲和力亚型结合),然后斜率平坦 (低亲和力亚型结合)3.2.1选择性放射配基的饱和曲线n应该指出,即使LT很小时,低亲和力亚型也不是完全不结合,所以不能把饱和曲线或Scatchard 曲线截然分成两段,前一段是高亲和力亚型结合,后一段是低亲和力亚型结合。实际上每段曲线都是两种亚型结构的总和,只是每种亚型所占比率多少不等而言n在实际分析数据工作中,首先需用合理的受体结合反应的数学模型,然后是运用计算机程序处理,才能得到两种亚型受体的RT和Kd值双位点饱和实验法 n运用Scatchard方程分两种受体亚型
7、,由于系统中放射配基L是相同的, 它们各自的结合方程为n实际上,实验中测量得到的是RL,而不是RL1和RL2,由于RL=RL1+RL2,所以 n (8)n上式中RL,L是实测值,RL1、RL2、Kd1、Kd2为四个待测参数。只要有足够多的实验点,就可以用最小二乘回归法去求四个参数,并根据参数再拟合成两种亚型的图形 111LKRTLRLd222LKRTLRLd2211LKRTLKRTLRLdd3.2.2 非选择性放射配基和选择性非放射配基竞争结合 n选用放射配基对两种亚型受体的亲和力相同,选用非放射配基对一种亚型有高的亲和力,对另一种亚型则是低亲和力n在一定浓度的放射配基和受体系统中加入不同浓度
8、的选择性非放射配基作竞争结合反应。高亲和力的配基容易与受体结合而取代放射配基,表现为部分结合位点在低浓度竞争剂即明显丧失放射性,而另一部分受体在高浓度竞争剂时对放射配基有明显抑制作用n和双位点饱和曲线一样,这种区分不是绝对的。必须通过计算机拟合才能得到两种亚型的各自参数3.2.2 非选择性放射配基和选择性非放射配基竞争结合n如果只有一种亚型受体系统,放射配基和选择性非放射配基(抑制剂)与受体反应,则n体系中R是共同的,解上述联立方程,得:n如果体系中有两种亚型受体,则 n n (9)RLLRKdRIIRKiRIRLRRTIKIRTRIi221121IKIRTIKIRTRIRIRIii3.2.3
9、 正负协同作用正负协同作用 n何谓正负协同作用?它是指当一部分受体与配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变的现象n亲和力下降称之为负协同作用;亲和力增大称之为正协同作用n在Scatchard图中,曲线斜率变小为负协同作用;曲线斜率变大为正协同作用Scatchard 图与正负协同作用 Hill方程与正负协同作用方程与正负协同作用 n用Hill作图法可判别协同作用的性质。其原理如下: 倘若一个受体可以和n个配基结合,并且Kd值相同, 则n移项,得n两边取对数,得n (10) RLLRLRTKnddnKLRLRTRLlglglglgLnKKLRLRTRLddnHill方程与正负协同作用方程与正负协同
10、作用n以 为纵坐标,lgL为横坐标作图:n直线的斜率为n,称为Hill系数lgRLRTRLHill系数与正负协同作用系数与正负协同作用n令 , 则n由于kd值不变,如果:nn=1, L1/2 = Kd , 简单单位点系统nn Kd , 体系中游离配基,受体亲和力,负协同作用nn1, L1/2 RT,在反应过程中LT变化很小,则n (12) 21RLkLRkdtRLd21RLkRLLTRLRTkdtRLd21RLkLTRLRTkdtRLdR+LRLk1k2结合速率常数 n当反应达到平衡时,dRL/dt = 0,设此时复合物的浓度为RLe ,则n n n (13)n将(13)式带入(12)式,得n
11、 n整理,得n (14)021eeRLkLTRLRTkdtRLd12eeRLLTRLRTkk11RLRLLTRLRTkLTRLRTkdtRLdeedtRLRTLTkRLRLRLdee1结合速率常数n(14)式积分,得n (15)n(13)式整理,得n (16)n将(16)式带入(15)式,得n (17)n令k表=k2+k1LT 为表观速率常数(复合物净生成速率常数),则n (18)tRLRTLTkRLRLRLeeln121LTkkRLRTLTetLTkktLTkkkRLRLRLe)()(ln12121tkRLRLRLe表ln解离速率常数 n当受体与配基的结合反应达到平衡时,加入大于100倍量的
12、非标记配基,使标记配基与受体不再结合而且平衡破坏,受体标记配基复合物发生解离,其速率为n (19)n重排,得n (20)2RLkdtRLddtkRLRLd2解离速率常数tkeeRLRL2n(20)式积分,得n (21a)n或n (21b)n当RL= RLe时, t=T1/2(复合物解离一半的时间)n所以n (22)tkRLRLe2ln2/122lnTk 受体-放射配基反应复合物时相曲线 RLeT1/2t=0速率常数测定n根据(B)曲线求复合物解离一半所需时间即T1/2 ,由(22)式求出k2n根据(A)曲线不同时间测得RL,以lnRL/RLeRL为纵坐标,t为横坐标作图,图中直线斜率由(18)
13、式知其为k表值n由k表=k2+k1LT,便可求得k1值 2/1T3.2.5 受体的竞争性和非竞争性受体的竞争性和非竞争性结合反应结合反应 n在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个化合物,它若能和受体结合,则会抑制放射配基与受体的结合反应n加入的化合物称为受体反应的抑制剂,抑制剂可以是激动剂,也可以是拮抗剂n拮抗剂按其作用机制又可分为竞争性拮抗剂和非竞争性的拮抗剂 3.2.5 受体的竞争性和非竞争性受体的竞争性和非竞争性结合反应结合反应n竞争性拮抗剂的抑制作用是它与激动剂竞争受体的相同或邻近的部位,竞争性拮抗剂与激动剂对受体结合作用是相互排斥,竞争性拮抗剂与受体结合只减少激动剂与受体的结合数
14、量n竞争性拮抗剂与受体结合后,不改变受体分子的结构,受体仍可与激动剂继续结合,而且可完全排除竞争性拮抗剂,表现出可逆反应的特性n非竞争性拮抗剂与受体结合后, 则改变受体分子的结构,激动剂不能排除拮抗剂,表现为不可逆反应特性n对拮抗剂竞争类型的鉴别是十分重要的, 鉴别的方法通常用双倒数作图法, 或Scatchard 作图法受体的竞争性和非竞争性受体的竞争性和非竞争性结合反应结合反应R + LRL+IRIKdKiKi竞争性Competitiveinhibition非竞争性NoncompetitiveinhibitionRIIRKiRLLRKdRLIIRLKi+IRLI竞争性拮抗的数学表达RIRLR
15、RTRLLRKdLRLKRdRIIRKiLKIRLKKIRRIidi(a)(b)(c)将b,c带入a, 得11idKILKRLRT重排,得1LKIKLRTRLid竞争性拮抗剂双倒数图 n图中的图中的I0是抑制剂浓是抑制剂浓度为零度为零, ,I1是是拮抗剂拮抗剂浓浓度为度为I1n直线的斜率为直线的斜率为n横轴截距为横轴截距为n纵轴截距为纵轴截距为1/RTn竞争性拮抗剂的特点竞争性拮抗剂的特点是随拮抗剂浓度的增是随拮抗剂浓度的增加受体的结合位点数加受体的结合位点数不变不变, ,而亲和性变小而亲和性变小 1111RTKIRTKLRLididKIRTK1idKIRTK1idKIK11idKIK111/
16、RT竞争性拮抗剂的Ki值 n拮抗剂Ki值称拮抗剂的抑制常数,或称拮抗剂的解离平衡常数n有竞争性抑制剂存在的平衡常数Kd表称为表观解离平衡常数, Kd表与Kd的关系如下: n n所以n (23)nKi值是表征拮抗剂与受体结合能力的物理常数,不受实验条件而变化 iddKIKK1表1ddiKKIK表非竞争性拮抗的数学表达RLIRIRLRRTRLIIRLKi11iidiiddKIKILKRLKIRLKLIRLKRLLRLKRTRLLRKdRIIRKi11iidKILKIKLRTRL重排,得非竞争性拮抗剂双倒数图 n直线的斜率为直线的斜率为n横轴截距为横轴截距为n纵轴截距为纵轴截距为n如果如果Ki=Ki
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