细胞生物学实验课件.ppt
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1、细胞生物学实验课件,实验三 植物细胞骨架的光学显微镜观察一.实验目的,1.掌握考马斯亮蓝R250对植物细胞骨架染色的方法。 2.通过对洋葱内皮细胞的处理,掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。 二.实验原理 细胞骨架(cytoskeleton),是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络 结构,根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、 微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运 输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。 本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时,可将细胞的 膜结构和大部分蛋白质抽提掉,但细胞骨架系统的蛋白却被保存
2、下来,后 者用考马斯亮蓝R250染色,在光学显微镜下可见一种网状结构。,三.实验用品,1.材料:洋葱 2.器材:显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、擦镜纸、50ml烧杯 药品:pH6.8的磷酸缓冲液; M-缓冲液 :50mmolL-1 (PH6.7)咪唑、 50 mmolL-1 KCl、0.5 mmolL-1 MgC12 、 1 mmolL-1 EGTA、 0.1 mmolL-1 EDTA、1 mmolL-1巯基乙醇、 4 mmolL-1甘油、 1 mmolL-1 HCl调pH至7.2;1%Triton-X100:用M-缓冲液配 制;3%戊二醛:用pH6.8的磷酸缓冲配制;0.2%考马斯亮蓝
3、R250染液:0.8g考马斯亮蓝R250、46.5ml甲醇、7ml冰醋酸、 46.5ml蒸馏水。,四.实验方法步骤,1.撕取洋葱鳞茎内表皮1cm2若干片,置于小烧杯中。 2.用磷酸缓冲液(pH6.8)提前浸泡2小时左右。 3.吸去磷酸缓冲液,用1% TritonX100处理20分钟。抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰。 4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗2次,每次5分钟。M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用。 5.用3%戊二醛固定0.51h。 6.用磷酸缓冲液(pH6.8)洗2次,每次5分钟。 7.考马斯亮蓝R250染色30分钟。 8.蒸馏水洗2次。 9.置于载玻片上,盖上盖玻片,在光学显微镜下观察。 五. 实验报告 1.绘出洋葱鳞叶内表皮细胞内细胞质骨架的分布图。 2.说明实验过程中各步骤处理的作用。,细胞骨架,
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