TUNEL法检测细胞凋亡.doc
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1、如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流TUNEL法检测细胞凋亡【精品文档】第 4 页细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时,暴露的3-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP),从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂,但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一
2、方面可以把凋亡和坏死区分开,另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。针对问题2( TUNEL法的实验原理是什么?):基本原理: 对不同组织切片先增加细胞膜通透性,然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内,在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3-OH结合,再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP上的biotin结合(每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子),最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。1.TUNE
3、L工作原理 :简单说就是TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是;生物素(biotin)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3OH末端,并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)特异结合,在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)的存在下,产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被染色。针对问题3(TUNEL
4、实验中几个关键步骤是什么?):1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min,再用二甲苯两次510min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀;2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用1030min,几um切片用短时间;几十um切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至2h,但要结合你最终的背景着色。4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过30
5、min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液(桃红色),不利于辨认棕褐色。5.PBS的充分清洗。我个人认为,在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格,可增加次数达5次,因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。6. 此外,内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法?1. 蛋白酶K是消化膜蛋白,从而起打孔作用,增加膜通透性,使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应;2. 蛋白酶K一般工作液浓度为20
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