DNA克隆技术.ppt
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1、目目 录录一、概述一、概述(一)基本概念(一)基本概念 1 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning), 即即无性繁殖无性繁殖。2 动物克隆动物克隆3 杂交杂交目目 录录克隆羊:克隆羊: 个体水平个体水平细胞克隆:细胞克隆: 细胞水平细胞水平DNA克隆:克隆: 分子水平分子水平目目 录录卵细胞C母绵羊子宫母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术妊娠目目 录录目目 录录目目 录录5 DNA克隆克隆应用酶学的方法,在
2、体外将各种来源的遗传应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA)与载体)与载体DNA接合成一具有自我接合成一具有自我复制能力的复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon),继而,继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一D N A 分 子 , 也 称分 子 , 也 称 基 因 克 隆 或 重 组基 因 克 隆 或 重 组 D N A (recombina
3、nt DNA) 。 目目 录录生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质) 6 基因工程基因工程(genetic engineering) 实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。目目 录录目目 录录目目 录录(二)重组(二)重组DNA技术的发展史技术的发展史年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交
4、试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司,专门应用重组程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉目目 录录目目 录录 重组重组DNA医药产
5、品医药产品目目 录录目目 录录(三)重组(三)重组DNA技术技术路线技术技术路线目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 目目 录录二、重组二、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶目目 录录(一)限制性核酸内切酶(一)限制性核酸内切酶1 核酸酶的分类核酸酶的分类2 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是是识别识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切割双
6、链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第四个字母代表株;第四个字母代表株;用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。3 命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目目 录录共性共性 (1)只作用于双链)只作用于双链DNA (2)活性有赖于
7、)活性有赖于Mg2+ (3)碱基识别特异性)碱基识别特异性 (4)切口形式)切口形式6 使用原则及注意事项使用原则及注意事项 4 分类分类、(基因工程技术中常用(基因工程技术中常用型)型)目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 :平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口目目 录录n(二)大肠杆菌(二)大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶n(三)(三)T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶n(四)(四)T
8、aqDNA聚合酶聚合酶n(五)反转录酶(五)反转录酶n(六)连接酶(六)连接酶n(七)末端(脱氧核苷酸)转移酶(七)末端(脱氧核苷酸)转移酶n(八)碱性磷酸酶(八)碱性磷酸酶目目 录录 直接从染色体直接从染色体DNADNA中分离中分离 人工合成人工合成 1.601.60元元/ /碱基碱基 基因文库基因文库 反转录反转录PCR PCR mRNA cDNAmRNA cDNA PCR PCR 直接索取直接索取分分目目 录录 (二)(二) 基因载体基因载体定义定义能携带目的基因进入宿主细胞并且在能携带目的基因进入宿主细胞并且在宿主细胞中进行扩增和表达的一类宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分分子。子
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