MGB探针设计原则(5页).doc
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1、-MGB探针设计原则 先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 所选序列应该高度特异,尽量选择具有最小二级结构的扩增片段这是因为二级结构会影响反应效率,而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测,如果不能避免二级结构,那么就要相应提高退火温度。 扩增长度应不超过400bp,理想的最好能在100-150bp内,扩增片段越短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 保持GC含量在20和80之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G
2、) 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。 引物设计原则 序列选取应在基因的保守区段 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。 Tm值在5565(因为60核酸外切酶活性最高),GC含量在40%60% 引物之间的TM相差避免超过2 引物的3端避免使用碱基A,引物的3端避免出现3个或3个以上连续相同的
3、碱基 为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。 Taqman探针技术要求片段长度在50bp150bp 引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。 探针设计原则 探针位置尽可能地靠近上游引物 探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性 检测探针的DNA折叠和二级结构 Tm值在65-70,通常比引物TM值高5-10(至少要5),GC含量在40%70% 探针的5端应避免使用G鸟嘌呤因为5G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。 整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。 为确保引物探针
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- MGB 探针 设计 原则
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