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1、DNA提取方法CTAB-溶菌酶法 1.取1mL菌液于2mlEP离心管中,12000rpm离心310min,弃上清。(取1-2ml菌液) 2.加入500LTE缓冲液洗涤2次,然后12000rpm离心3min,收集沉淀菌体。 3.沉淀菌体用500lTE缓冲液震荡重悬,加入50mg/mL的溶菌酶50l,37水浴30min,每15min 轻柔混匀一下。 4.加入60L10%SDS和10l的蛋白酶K,在37水浴2h,每隔15min轻摇一下。然后加入50L5M 的NaCl(放4)和80L的CTAB/NaCl(CTAB65预热一下成糊状,吸取最底部液体)溶液65水浴30min,每隔15min轻摇一下。 5.
2、加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),剧烈震荡5-10min,12000rpm离心10min,取上 清液(切记勿吸到下层),该步骤操作2次。 6.在抽提到的DNA上清液中加入0.1倍体积的3M的NaAC,再加入100%1倍体积的预冷冰乙醇,轻 轻混匀,-18过夜。 7.将离心管取出,12000rpm,4,10min,弃上清,沉淀用1ml预冷的70%的乙醇洗涤吹打,12000rpm, 10min,该步骤操作2次。用吸水纸轻轻吸干液体,无菌风吹干。 8.加入40LTE(or娃哈哈)回溶,37保温2h,放到4冰箱过夜。-20冰箱保存备用。 各试剂的作用: SDS:十二烷基磺酸钠Sodium
3、 dodecyl sulfate,SDS常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA 分开 CTAB/NaCl:CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,同时不沉淀核酸,通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂志后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1):酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA 分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振
4、荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。 NaAC:在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。 试剂配制【所有水用哇哈哈水】 1、10%SDS(十二烷基
5、硫酸钠):SDS 10g溶于80ml去离子水中(哇哈哈水),加热至68助溶,用HCL调pH至7.2,定溶至100ml,室温保存。因其有毒,需在使用及配制过程中带手套操作。 2、蛋白酶k(20mg/ml):将200mg的蛋白酶k离心摔入管底后加入9.5ml水,轻轻摇动(不要涡旋混合)直至蛋白酶k完全溶解。加水定溶至10ml,以每管12-13L的量分装小份(通常用10L的量),贮存于-20。避免反复冻融,可有效保证6-12月。PH=4-12.5范围内均有活性。 3、5M NaCL (即5mol/L浓度):称取29.25gNACL溶解于50mL水中,搅拌溶解,加水定容至100mL。 4、3mol/L
6、NaAc溶液(pH4.8):称取无水乙酸钠49.2g,先加140mL水,加热使溶解,再用冰乙酸约40mL调至pH至4.8,加水定容至200mL,高压灭菌20min,置4保存。 5、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1):放入到棕色瓶中,放入冰箱4保存。记得要在通风橱内完成,做好防护措施!(上层会有一层分层,就是带出来的Tris饱和酚的上层,所以把枪伸到稍下的地方取液体) 6、溶菌酶(50mg/mL):用水配制成50mg/mL的溶菌酶溶液,分装成小份并保存于-20 。每小份一经使用后就便予丢弃。后用50 L,所以配60L。 7、CTAB/NaCL溶液(10% CTAB,0.7MNaCL):称取4.0
7、95g(0.7M*0.1L*58.5=4.095)NaCL 和10g CTAB用适量水(约50mL)溶解,加水定容至100mL. 8、70%乙醇:现配现用 9、Tris-HCL缓冲液(pH=8.0):称量121.1gTris置于1L烧杯中,加入约800ml的水中,充分搅拌溶解。加入约42ml浓盐酸调pH至8.0,将溶液定容至1L,高温高压灭菌后,室温保存。(注:应使溶液冷却至室温后再调pH值,因为温度升高,Tris溶液的pH 值会相应降低。) 10、0.5MEDTA(乙二胺四乙酸钠):称取186.1gNa2EDTA*H2O,置于1L烧杯,加入800mL 蒸馏水,充分搅拌。用NaOH调pH至8.0(约20gNaOH)(注意:pH至8.0时,EDTA才能完全溶解)。加水将溶液定溶至1L,适量分成小份后,高温高压灭菌,室温保存。11、10TE缓冲溶液(pH7.4,7.6,8.0):吸取100mLTris-HCL缓冲液和0.5M EDTA20mL 于1L烧杯中,向烧杯中加入约800mL的去离子水,均与混合。将溶液定溶至1L,高温高压灭菌,室温保存。使用时,吸取1mL 10倍TE缓冲液,加入9mL去离子水即可。 继续阅读
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