2022年TUNEL原理和方法 .pdf
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1、TUNEL 法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb 的大片段。然后大约30 的染色体DNA在 Ca 2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成 180200bp 核小体 DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的 3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的 3-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移
2、酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被染色。低分子量的 DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译(nick translation),使低分子量的 DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞。TUNEL 或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞
3、凋亡的研究中已被广泛采用。一、过氧化物酶标记测定法原理:脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛(digoxigenin)-11-dUTP 在 TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的 3-OH末端,与 dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到 1,若此抗体的Fc 部分通过蛋白酶
4、水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc 受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。检测晚期凋亡。基本原理:对不同组织切片先增加细胞膜通透性,然后让 rTDT 和 bio 标记的 dTUTP进入细胞内,在 rTDT 的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3-OH结合,再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上 biotin结合(每个链霉亲和素至少可以再结合3 个 biotin分子),最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL
5、阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。罗氏试剂盒一、试剂 1、酶浓缩溶液550 l 末端脱氧核糖核酸转移酶(10)试剂2、标记溶液5550l 含有核苷酸混合液的反应液(1)试剂3、转化剂-POD 3.5ml 酶标记抗荧光素抗体(即用型,融后4保存)二、所需的溶液和仪器10mM Tris/HCl(pH7.47.8)、PK配制、DAB、饭盒、吹风机、3%H2O2 甲醇溶液、PBS、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇(用量多)、双蒸水(用以配梯度酒精)1,充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60 度 20min,石蜡切片于染色缸中,二甲苯浸洗2 次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙
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