实验改良法测定血清总胆红素和结合胆红素讲稿.pptx
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1、实验改良法测定血清总胆红素和结合胆红素第一页,讲稿共二十九页哦一一.目的要求目的要求掌握本法测定血清胆红素的基本原理。熟悉本法测定血清胆红素的基本操作步骤及参考值。了解临床测定血清胆红素的主要方法及意义。第二页,讲稿共二十九页哦二实验原理二实验原理血清中结合胆红素结合胆红素可直接与重氮试剂重氮试剂反应,生成紫色的偶氮胆红素偶氮胆红素;在同样条件下,未结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应。咖啡因、苯甲酸钠作为加速剂,醋酸钠缓冲液可维持反应的pH值同时兼有加速作用。(叠氮钠破坏剩余重氮试剂,终止结合胆红素测定管的偶氮反应。)最后加入碱性酒石酸钠,在碱性条件下,紫色偶氮胆红素转变为
2、蓝色偶氮胆红素,使最大吸光度由530nm转移到598nm,此时,非胆红素的黄色色素及其他红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计,使测定的灵敏度和特异性增加。最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。第三页,讲稿共二十九页哦三器材及试剂三器材及试剂1器材:器材:(1)试管(2)刻度吸管(3)紫外-可见分光光度计(4)恒温水浴箱第四页,讲稿共二十九页哦三器材及试剂三器材及试剂2试剂试剂:咖啡因咖啡因-苯甲酸钠试剂苯甲酸钠试剂 称取无水醋酸钠14.0g,苯甲酸钠37.5g,乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.5g,溶于500ml蒸馏水中,再加咖啡因25.
3、0g,搅拌至完全溶解(不可加热),用蒸馏水稀释至1000ml。混匀,过滤,置棕色瓶中,室温保存。碱性酒石酸钠溶液碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠75.0g,酒石酸钠(Na2C4H4O62H2O)263.0g,用蒸馏水溶解并稀释至1000ml。混匀,置塑料瓶中,室温保存(每排配150mL,计算后给老师确认后方可配制)。5.0g/L亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠(NaNO2)0.5g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml,混匀,置棕色瓶中,4保存。若溶液呈淡黄色时,应丢弃重配。5.0g/L对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸(NH2C6H4SO3HH2O)5.0g,加蒸馏水800ml
4、及浓盐酸15ml,待完全溶解后加蒸馏水稀释至1000ml,混匀(每排配100mL,计算后给老师确认后方可配制)。重氮试剂重氮试剂 临用前取5.0g/L亚硝酸钠0.5ml和5.0g/L对氨基苯磺酸溶液20ml,混匀。第五页,讲稿共二十九页哦三器材及试剂三器材及试剂2试剂试剂:胆红素标准胆红素标准 稀释血清:收集无溶血、无黄疸、无脂浊之新鲜血清,过滤。取过滤血清0.2mL,加入4.8mL新鲜生理盐水,混匀。以生理盐水调零,比色杯光径10mm,稀释血清在414nm吸光度应小于0.100,460nm吸光度应小于0.040。胆红素标准液(171mol/L或10mg/dL):称取符合标准的胆红素(MW:5
5、84.68)10mg,加入二甲亚砜1mL,玻棒搅匀,加入0.05mol/L Na2CO3溶液2mL,使胆红素完全溶解。移入100ml容量瓶,用稀释血清洗涤数次并移入容量瓶中,缓慢加入0.1mol/L HCl溶液2mL(边加边缓慢摇动,切勿产生气泡),最后用稀释血清稀释至100mL。避光,4保存,3天内有效,最好当天绘制标准曲线。第六页,讲稿共二十九页哦四操作步骤四操作步骤1标准曲线的绘制:标准曲线的绘制:按下表配制5种不同浓度的胆红素标准液 将以上各管充分混匀(不产生气泡)。试剂(ml)/管别0 1 2 3 4 5 胆红素标准液(171mol/L)0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
6、 稀释血清1.00.8 0.6 0.4 0.2 0.0相当于胆红素浓度 mol/L mg/dl34.2 68.4 103 137 1712 4 6 8 10 第七页,讲稿共二十九页哦四操作步骤四操作步骤1标准曲线的绘制:标准曲线的绘制:不同浓度的胆红素标准液按下表操作试剂(mL)不同浓度的胆红素标准液0.2咖啡因-苯甲酸钠试剂1.6重氮试剂 0.4 混匀,总胆红素管置室温15分钟,按下表继续操作:碱性酒石酸钠溶液1.2每一浓度平行做二管,取平均值。用空白管调零,于波长600nm,读取各管吸光度,然后与相应的胆红素浓度绘制标准曲线第八页,讲稿共二十九页哦四操作步骤四操作步骤2总胆红素总胆红素的测
7、定:的测定:取3支试管(总胆红素2组平行,空白管1管),标明总胆红素管和空白管,然后按下表操作试剂(ml)/管别总胆红素管空白管血清0.20.2咖啡因-苯甲酸钠试剂1.61.6氨基苯磺酸溶液0.4重氮试剂 0.4 混匀,总胆红素管置室温15分钟,按下表继续操作:碱性酒石酸钠溶液1.21.2 充分混匀后,用空白管调零,于波长600nm,读取总胆红素管的吸光度,在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。第九页,讲稿共二十九页哦五五实验结果实验结果 A总胆红素=?血清总胆红素=?第十页,讲稿共二十九页哦六六注意事项注意事项参考值参考值 血清总胆红素 5.119mol/L(0.31.1mg/dl)血清结合胆红
8、素 1.76.8mol/L(0.10.4mg/dl)在1037范围内,本测定方法不受环境温度影响,呈色在2小时内稳定。严重溶血时,可导致测定结果偏低。血脂可影响测定结果,故应尽量取空腹血。胆红素对光敏感,胆红素标准液及血清样本均应避光。第十一页,讲稿共二十九页哦七七相关知识与相关知识与临床意义临床意义胆色素胆色素代谢代谢 胆色素(bile pigment)是体内铁卟啉类化合物的主要分解代谢产物,包括胆绿素(biliverdin)、胆红素(bilirubin)、胆素原(bilinogen)和胆素(bilin)等。胆红素处于胆色素代谢的中心,是人体胆汁中的主要色素。第十二页,讲稿共二十九页哦七七相
9、关知识与相关知识与临床意义临床意义胆红素空间结构示意图胆红素空间结构示意图 胆红素的特有结构赋予其亲脂疏水的性质,易自由透过细胞膜进入血液。NN HNNOCOOOHCOHHOHH第十三页,讲稿共二十九页哦七七相关知识与相关知识与临床意义临床意义1.胆红素主要源于血红素的降解胆红素主要源于血红素的降解(1)胆红素主要源于衰老红细胞的破坏)胆红素主要源于衰老红细胞的破坏体内的铁卟啉化合物包括血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化氢酶及过氧化物酶。正常人每天可生成250350mg胆红素,其中约80%以上来自衰老红细胞破坏所释放的血红蛋白的分解。第十四页,讲稿共二十九页哦七七相关知识与相关知识与临床意义
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- 实验 改良 测定 血清 胆红素 结合 讲稿
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