电镜样品的基本制备技术之负染色技术课件.ppt
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1、关于电镜样品的基本制备技术之负染色技术现在学习的是第1页,共38页 负染色又称阴性反差染色,它是利用负染色又称阴性反差染色,它是利用高密度的、且在透射电镜下又显示结构的高密度的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐(如磷钨酸、醋酸铀等),把生重金属盐(如磷钨酸、醋酸铀等),把生物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染色所显示的电镜图像,正好与超薄切片正色所显示的电镜图像,正好与超薄切片正染色相反,其样品结构为透明浅色,而背染色相反,其样品结构为透明浅色,而背底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色
2、底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制,目前还不够清楚。的机制,目前还不够清楚。现在学习的是第2页,共38页 负染色技术首先,由负染色技术首先,由Ha11(1955)、)、Hux1ey(1957)等人所采用,在后来的生)等人所采用,在后来的生物学研究中得到了越来越广泛的应用。负物学研究中得到了越来越广泛的应用。负染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作,而是直接对沉降的样薄切片等复杂操作,而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术相比,该技术具有操作简便、用药量极少、相比,该技术具有操作简便、用
3、药量极少、省时快速及分辨力高等优点,现广泛用于省时快速及分辨力高等优点,现广泛用于细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及分离的细胞器等研究工作。分离的细胞器等研究工作。现在学习的是第3页,共38页 特别是在病毒学领域,负染色更特别是在病毒学领域,负染色更能发挥其独到作用,是一项很重要能发挥其独到作用,是一项很重要的实验技术。的实验技术。现在学习的是第4页,共38页 、负染样品的制备、负染样品的制备 负染色所用的样品,全部取自悬浮液。负染色所用的样品,全部取自悬浮液。在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度和纯度,这样才能与染色剂
4、之间产生特异和纯度,这样才能与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。操作时,将带有样品和清晰的结合反应。操作时,将带有样品的悬液,滴于带有支持膜的铜网上,染色的悬液,滴于带有支持膜的铜网上,染色处理后即可进行电镜观察。其全部制备过处理后即可进行电镜观察。其全部制备过程分述于下。程分述于下。现在学习的是第5页,共38页 ()浓缩取样法)浓缩取样法 适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。红细胞吸附法红细胞吸附法 主要用于粘液病毒主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制备。其操作方法为:将和副粘液病毒的制备。其操作方法为:将病毒悬液与等量红细胞混合,放置病毒悬液与等量红细胞混合,放置
5、5分钟,分钟,使病毒吸附于红细胞表面;使病毒吸附于红细胞表面;现在学习的是第6页,共38页 而后,以而后,以800转分速度低速离心转分速度低速离心15分钟,分钟,使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底;最使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底;最后,弃去上清液,加入少量生理盐水,于后,弃去上清液,加入少量生理盐水,于室温下或冰箱中存放室温下或冰箱中存放34小时,病毒即可小时,病毒即可从红细胞表面释放到上面的溶液里,取溶从红细胞表面释放到上面的溶液里,取溶液滴在铜网载膜上,进行后染色处理。液滴在铜网载膜上,进行后染色处理。现在学习的是第7页,共38页 2低渗释放法低渗释放法 从培养瓶中刮下所从培养瓶中刮下所
6、培养的腺病毒或疱疹病毒,低速离心,弁培养的腺病毒或疱疹病毒,低速离心,弁上清液,于沉淀物中加入培养液与蒸馏水上清液,于沉淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液(比例为的混合液(比例为1:4),使细胞因低渗),使细胞因低渗破裂而释放出病毒,然后快速冻融数次,破裂而释放出病毒,然后快速冻融数次,再将冻融后的悬液低速离心,取其上清液再将冻融后的悬液低速离心,取其上清液滴膜染色。滴膜染色。现在学习的是第8页,共38页 3抗体抗体 病毒凝集沉淀法病毒凝集沉淀法 某些病毒某些病毒如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝炎抗原等,可于相应的抗体及甲、乙型肝炎抗原等,可于
7、相应的抗体形成病毒一抗体复合物,经离心沉淀而浓形成病毒一抗体复合物,经离心沉淀而浓缩,而后取浓缩的沉淀物滴膜染色,可找缩,而后取浓缩的沉淀物滴膜染色,可找到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于病毒疾病的快速诊断。病毒疾病的快速诊断。现在学习的是第9页,共38页 (二)直接取样法(二)直接取样法 对于某些皮肤病毒性疱疹(如天花、对于某些皮肤病毒性疱疹(如天花、水痘及疱疹等)可用毛细吸管直接刺入疱水痘及疱疹等)可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样,再将吸管中的泡液滴在带有支疹中取样,再将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上,待稍干后立即染色观察。持膜的铜网上,待稍干后立即
8、染色观察。此法主要用于临床快速诊断此法主要用于临床快速诊断现在学习的是第10页,共38页 对于生长在固体培养基上的微生物,对于生长在固体培养基上的微生物,可用白金环刮取,再用缓冲生理盐水稀释可用白金环刮取,再用缓冲生理盐水稀释成悬液,即可滴样,待稍干后染色观察。成悬液,即可滴样,待稍干后染色观察。对于生长在琼脂板上的噬菌体斑,也可采对于生长在琼脂板上的噬菌体斑,也可采用直接取样法。用直接取样法。现在学习的是第11页,共38页 (三)离心提纯法(三)离心提纯法 用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提
9、纯。先用低速离心(先用低速离心(3000转分),弃去较大转分),弃去较大杂质和细胞碎片再用适当孔径的滤膜过杂质和细胞碎片再用适当孔径的滤膜过滤,其滤液再经低温超速离心,最后取沉滤,其滤液再经低温超速离心,最后取沉淀物制成悬液滴样染色。淀物制成悬液滴样染色。现在学习的是第12页,共38页 二、染液的配制二、染液的配制 一般均由重金属盐配制。最常用的有一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸(磷钨酸(PTAPTA)、磷钨酸钾()、磷钨酸钾(KPTKPT)、磷钨)、磷钨酸钠(酸钠(NaPTNaPT)、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵)、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等等。当使用磷钨酸或磷钨酸盐时,可用蒸。当使用磷钨酸或
10、磷钨酸盐时,可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成馏水或磷酸缓冲液配制成0.53的溶的溶液,染色前应用:液,染色前应用:现在学习的是第13页,共38页N的氢氧化钠或氢氧化钾将的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到值调到6.47.0。醋酸铀则用。醋酸铀则用0.20.5水液水液pH为为4.55.5,染液在用前新鲜配制,盐溶解,染液在用前新鲜配制,盐溶解需需2030分钟。钼酸铵配制成分钟。钼酸铵配制成23溶液,溶液,使用时用醋酸铵将使用时用醋酸铵将pH调至调至7.07.4之间。之间。现在学习的是第14页,共38页作为负染色剂的条件:作为负染色剂的条件:(l)具有较高的电子密度和较强的电子)具有较高的电子密度和较强的
11、电子散射能力;散射能力;(2)耐受电子束的轰击、在电子束照射)耐受电子束的轰击、在电子束照射下不升华;下不升华;(3)在电镜下不呈现染色剂本身的结构;)在电镜下不呈现染色剂本身的结构;(4)化学稳定性好,不析出沉淀,与样)化学稳定性好,不析出沉淀,与样品不发生化学反应,易在不规则样品表面品不发生化学反应,易在不规则样品表面渗透。渗透。现在学习的是第15页,共38页三、负染色操作方法三、负染色操作方法()滴染法)滴染法将制备好的悬浮液样品将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸用毛细吸管吸取,滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液取,滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液内样品的浓度内样品的浓度,立即或放置数分钟
12、后,用滤立即或放置数分钟后,用滤纸从液珠边缘吸去多余液体,即可滴上染纸从液珠边缘吸去多余液体,即可滴上染液,染色时间液,染色时间12分钟而后即可用滤纸分钟而后即可用滤纸吸去染液,待干燥后即可电镜观察。吸去染液,待干燥后即可电镜观察。现在学习的是第16页,共38页注意事项:注意事项:(l)操作时吸管不能离铜网太近,应让液)操作时吸管不能离铜网太近,应让液滴离开吸管后自然滴下,否则液滴易将铜滴离开吸管后自然滴下,否则液滴易将铜网吸起;(网吸起;(2)支持膜应完好无损,吸管不)支持膜应完好无损,吸管不能太粗,液滴不能太大,否则都不能形成能太粗,液滴不能太大,否则都不能形成良好的液珠;(良好的液珠;(
13、3)病毒在液滴的边缘分布)病毒在液滴的边缘分布较多,操作时不宜用滤纸吸干,而任其自较多,操作时不宜用滤纸吸干,而任其自然稍干后再加染液。然稍干后再加染液。现在学习的是第17页,共38页(二)漂浮法(二)漂浮法先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上,先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上,再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠上漂浮以沾取样品;然后,用滤纸吸干铜上漂浮以沾取样品;然后,用滤纸吸干铜网上的多余悬液,再将铜网在染液滴珠上网上的多余悬液,再将铜网在染液滴珠上漂浮,时间漂浮,时间2分钟,最后再用滤纸将染分钟,最后再用滤纸将染液吸干即可观察。液吸干即可观察。现在学习的
14、是第18页,共38页四、影响负染效果的有关因素四、影响负染效果的有关因素()掌握染色时机)掌握染色时机 染色应在铜网上的染色应在铜网上的悬液将要干燥而又没完全干燥时进行,如悬液将要干燥而又没完全干燥时进行,如果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染色,则严重影响染色效果,便得不到理想色,则严重影响染色效果,便得不到理想的负染电镜图像。的负染电镜图像。现在学习的是第19页,共38页(二)控制(二)控制pH值悬浮液与染液的值悬浮液与染液的pH值对负染效值对负染效果有着明显影响,一股应使悬液呈中性或略偏酸性为宜果有着明显影响,一股应使悬液呈中性或略偏酸性为宜(pH6.
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