建立快速鉴定凤尾菇菌株的SCAR标记(江西农业大学学报).pdf
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1、 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/江西农业大学学报 2010,32(3):0601-0607http:/Acta Agriculturae Universitatis JiangxiensisE-mail:利用RAPD和SRAP建立快速鉴定凤尾菇菌株的SCAR标记熊 芳,郑闽江,刘新锐,谢宝贵3(福建农林大学 菌物研究中心,福建 福州350002)摘要:为建立一套基于DNA分子标记技术快速鉴定凤尾菇菌株的有效方法,首先对生产上常用的9个凤尾菇菌株进行RA
2、PD和SRAP多态性分析,从巴西凤平、高温凤尾菇、327和凤尾菇4个菌株中分别获得了片段长度为1 760 bp、356 bp、1 113 bp和400 bp的4条特异片段,将其克隆、测序、引物设计,成功转化为4个稳定的SCAR标记。试验结果表明,利用这些特异SCAR标记,能在1 d内有效地解决9个凤尾菇菌株中的“同名异物”和“同物异名”现象,快速鉴定凤尾菇菌株,最终证实SCAR标记在凤尾菇菌株快速鉴定上的可行性和可靠性。关键词:凤尾菇;分子标记;RAPD;SRAP;多态性;SCAR标记中图分类号:Q939.9 文献标志码:A 文章编号:1000-2286(2010)03-0601-07Deve
3、lopment of SCARMarkers Based on RAPD andSRAP for Rapid Identification ofPleurotus sajor-cajuStrainXI ONG Fang,ZHENGMin2jiang,L I U Xin2rui,XIE Bao2gui3(Mycological Research Center,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)Abstract:This study was designed for the purpose of estab
4、lishing an effective way for rapid identificationofPleurotus sajor-cajustrains based on DNA molecular marker.The RAPD(random amplified polymorphicDNA)and SRAP(sequence-related amplified polymorphis m)analysiswere conducted on 9 cultivated strainsofPleurotus sajor-caju.Four specific fragments with a
5、length of 1 760 bp,356 bp,1 113 bp and 400 bpcould be generated from the Brazilian Ping Pong,Temperature Pleurotus,327 strain,Pleurotus.Subsequent2ly,they were converted into more stable SCAR(sequence characterized amplified region)markers by cloning,sequencing and pri mer design.The results showed
6、that these SCAR markers acquired based on this study couldbe used as a specific DNA fingerprint to identify the homonym and synonym inPleurotus sajor-cajuwhithinone day.The feasibility and reliability of adopting strain-specific SCAR markers for the rapid identification ofPleurotus sajor-cajustrains
7、were confirmed.Key words:Pleurotus sajor-caju;molecularmarker;RAPD;SRAP;polymorphism;SCAR marker凤尾菇(Pleurotus sajor-caju)是一种热带和亚热带林区常见的野生食用菌,1974年在印度首次驯化栽培成功,1980年前后,张树庭、刘中柱和费孝通等先后将印度凤尾菇经香港和澳大利亚引入中国。由于它适应性和抗逆性强,成本低产量高,味道鲜美,营养丰富,很快便成为全国广泛栽培的食用菌1。收稿日期:2010-03-16 修回日期:2010-05-12基金项目:福建省科技重大专项资助项目(2008S
8、Z0002)作者简介:熊芳(1983-),女,硕士,主要从事食用菌研究,E-mail:kitty830515 ;3 通讯作者:谢宝贵,教 授,E-mail:。1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/江 西 农 业 大 学 学 报第32卷由于凤尾菇和侧耳属其他菇的形态和生物学特性相近,再加上各栽培区菌种相互串引,栽培出菇后冠以新名又使得凤尾菇同种异名或同名异种的现象十分严重。不但给科学研究和学术交流带来障碍,而且对规范生产和产品质量标准的制定带来很大困难。因此,必
9、须采用客观、快速、稳定可靠并有较高区分能力的鉴定技术用于菌种鉴定。分子标记技术能够直接反映DNA水平上的差异,不受环境因素影响,具有高度的特异性,因而成为当今较先进的种质鉴定技术2。目前,尚未见利用RAPD、SRAP及SCAR标记对中国凤尾菇主要栽培菌株进行菌株鉴定的报道。本试验选用生产上常用的9个凤尾菇栽培菌株,在RAPD和SRAP指纹图谱分析的基础上,筛选得到4条特异性条带,并将其转化成稳定的SCAR标记。SCAR标记一般表现为扩增片段的有无,是一种显性标记,可以使不同材料的DNA差异通过单一条带的出现与否加以判断,检测方便、快捷,可用于快速检测大量个体。1 材料与方法1.1 试验材料1.
10、1.1 供试菌株 用于制备感受态的菌株:Escherichia coli.DH-5。9株凤尾菇菌株均为福建省食用菌种质资源库(福建农林大学菌物研究中心)收集保藏菌种。试验编号、菌株名称、菌种来源列于表1。表1 供试凤尾菇菌株Tab.1Stra i ns ofPleurotus sajor-cajuused in the study菌株编号Strain No.菌株名称Strain name来源OriginPl.p 0001凤杰1号Feng Jie No.1福建省轻工业研究所Fujian light industry research institutePl.p 0002凤尾菇Pleurotus
11、sajor-caju福建农林大学Fujian agriculture and forestry universityPl.p 0003凤831 Feng831福建农林大学Fujian agriculture and forestry universityPl.p 0004凤尾PF1PleurotusPF1贵州习酒食用菌研究所Guizhou Xijiu mushroom institutePl.p 0005凤尾5号PleurotusNo.5贵州习酒食用菌研究所Guizhou Xijiu mushroom institutePl.p 0006巴西凤平Brazilian Ping Pong福建省轻工
12、业研究所Fujian light industry research institutePl.p 0007高温凤尾菇Temperature Pleurotus贵州习酒食用菌研究所Guizhou Xijiu mushroom institutePl.p 0008327福建三明真菌所Fujian Sanmingmycological institutePl.p 0009凤尾菇Pleurotus sajor-caju福建省农科院植保所FASI1.1.2 供试引物 引物通过前期试验筛选得到,选取的是扩增结果多态性高,具有丰富多态性位点的引物。所有引物均由上海闪晶生物公司合成。引物编号及序列见表2。表2
13、 供试引物Tab.2The pri mers used i n the study编号No.RAPD引物的碱基序列(5-3)The base sequence of RAPD primer(5-3)编号No.SRAP引物的碱基序列(5-3)The base sequence of SRAP primer(5-3)S10CTGCTGGGACme5TGAGTCCAAACCGGAAGS22TGCCGAGCTGme6TGAGTCCAAACCGGTAGS23AGTCAGCCACem8GACTGCGTACGAATTAGCS62GTGAGGCGTCem6GACTGCGTACGAATTGCA1.1.3 生化试
14、剂 使用UN I Q-10柱式回收试剂盒回收特异条带,购自上海Sangon;pMD18-T载体、Taq酶、dNTPs等均购自TaKaRa公司(大连):其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。1.2 试验方法1.2.1 菌丝培养及DNA提取 改良CTAB法3。1.2.2 凤尾菇菌株差异性片段的获得及其序列测定 使用表2中的RAPD和SRAP引物,对供试的凤206 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/第3期熊 芳等:利用RAPD和SRAP建立快速鉴定凤尾菇菌株的SCA
15、R标记尾菇菌株进行PCR扩增,并对DNA指纹图谱进行分析,筛选出特异性DNA片段。以pMD 18-TVector为连接载体转化于E.coliDH-5,并委托大连宝生物公司进行序列测定。1.2.3SCAR-PCR分析 根据特异性DNA片段的测序结果,用Primer5.0设计出SCAR引物SCAR1和SCAR2。选取特异片段的原菌株和2个阴性菌株进行SCAR-PCR扩增,以验证SCAR标记的真实性并对SCAR引物的退火温度进行优化。利用SCAR引物在最适退火温度下对9个凤尾菇菌株进行扩增。SCAR反应体积25L,其中2.5L 10buffer,1.5 mmo1/L MgCl2,2L 12.5 mm
16、ol/L dNTPs,1 UTaqDNA聚合酶,0.5L 10mo1/L上、下游引物,20 ng基因组DNA,用ddH20补足体积。SCAR-PCR反应程序:94 预变性5 min;94 变性1 min,复性1 min(退火温度根据所设计的SCAR引物而定),延伸721.5 min,30个循环:72 延伸10 min。产物用12 g/L琼脂糖凝胶电泳,于凝胶成像系统拍照并分析(泳道和菌株编号一一对应)。2 结果与分析2.1RAPD-PCR和SRAP-PCR指纹图谱分析使用扩增重复性好、多态性明显的S10、S22、S62引物和me6-em6引物对供试的9个凤尾菇菌株分别进行RAPD-PCR和SR
17、AP-PCR扩增。其中,引物S10在6号巴西凤平菌株中扩增出1 760 bp的特异性条带(图1),引物S22在9号凤尾菇菌株中获得356 bp的特异性条带(图2)、引物S62在8号327菌株中获得1 113 bp的特异性条带(图3),引物对me3-em6在7号高温凤尾菇菌株中获得400 bp的特异性条带(图4),将这四条特异性DNA片段,用UN I Q-10柱式回收试剂盒进行回收纯化。图1 引物S10对9个凤尾菇菌株的扩增结果Fig.1Amplification result of the 9 strainsofPleurotus sajor-cajuby primer S10图2 引物S22
18、对9个凤尾菇菌株的扩增结果Fig.2Amplification result of the 9 strainsofPleurotus sajor-cajuby primer S22图3 引物S62对9个凤尾菇菌株的扩增结果Fig.3Amplification result of the 9 strainsofPleurotus sajor-cajuby primer S62图4 引物me3-em6对9个凤尾菇菌株的扩增结果Fig.4Amplification result of the 9 strainsofPleurotus sajor-cajuby primerme3-em62.2 特异性
19、片段的序列测定及SCAR标记的建立特异性片段经克隆并进行阳性重组体鉴定后,即用于测序。采用DNAMAN软件均能找到用于扩增多态性片段所用的引物(图5-图8加方框部分),进一步证实了扩增片段的正确性。根据SCAR引物设计原则和原来引物序列,利用Primer Premier5.0软件设计了4对SCAR引物(表3)。306 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/江 西 农 业 大 学 学 报第32卷CGGCCAGTGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC
20、GATT CTGCTGGGAC GGGAGTGGGTGTTTGGGTAAATGTCTTCAAGGAATCGAAGAATCTTGGCAACCCCTTCAGCCTTTGCAAACTTGCGCCAGGCAATAACAACTCCACATGGGGCACAGAGTGTCTCCACACAGTAGAACCTGGGGGCAGAGAAGTAGTTGTTGTACTTGGTGCCACTGACCTCTTCATTCTCTTGCTCCTCCAGGTTGTCATGTTCCAGTTCCTCTGCTTCTCCACCAGCAGGCAACCACTCCTGCCTCTCTTCCTGAGCTCTTCTCAACATCCTCTGAACTCCT
21、AAGAGTGAGGAGTTGGCATAGCGTCTGCGGAATTTGGCCCACTGTGGCTGATGCTCTTCACAGGCCTGAGTATCACCAACCTTGTCTTCATGACAGTTCTTCATCCGACACTTTCCTTCCATAGCCTCTTCATGCTCCTCGCAGAACACCCCAGTTTGTGCATTAAGAAGTGCCTTCTCACACCCCTCCATGGCACAATGGCGTGGTCCCATGACAATACCATCAATGACGACCATGCGAACATCTGCTGCATTATTGGCAGGATCAATAGGACCAGCAGGTTCAACCACATCAGCAGGG
22、TTGTTGTCAACCTGCATTGCGTCTGGATCCACATTAGGACCCTCATAGTCTGGCACAACATGATTCTCATCATGGCCAACCGCAGCAGCAGGATCATTGGGCTGCCTTGGAATGACATCGGCAACATCTTTGAATGCATGGCAACATTCATCACAAGAGTGCCCAACTGCGCTGCGAACAATTCCTCCATCTCCAAGTTCAACATAGGCAGCAGCCACCAGAGCATCAATGGAGAGGTTGCTCTCAAACACGATTTCCCGGTTGTTGAAGCTGGCCATGTGACGGATAGACTCTGCAACA
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