酶切回收连接精选文档.ppt
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1、酶切回收连接本讲稿第一页,共二十一页质粒质粒DNA的酶切的酶切本讲稿第二页,共二十一页定义:识别定义:识别dsDNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶本讲稿第三页,共二十一页类内切酶作用特点类内切酶作用特点v能在特殊位点识别和切断能在特殊位点识别和切断dsDNA,识别序列,识别序列4-6bp,具有,具有回文结构回文结构(180度旋转对称结构)度旋转对称结构)vHind v产生产生5粘性末端粘性末端A AGCTTA AGCTTTTCGA ATTCGA AAAGCTTTTCGAA本讲稿第四
2、页,共二十一页vSst GAGCTCCTCGAG产生产生3粘性末端粘性末端GAGCT CGAGCT CC C TCGAGTCGAG粘端切口粘端切口本讲稿第五页,共二十一页GTCCAGHinHind dGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口本讲稿第六页,共二十一页第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第四个字母代表株;第四个字母代表株;用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。3、命名、命名:Hind Haemophilus influe
3、nzae d株株 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶 属属 系系 株株 序序v书写方法:前书写方法:前3个字母斜体个字母斜体本讲稿第七页,共二十一页酶活性单位酶活性单位v指在限定条件下(温度、指在限定条件下(温度、Buffer),),1hr消化消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位(的酶量称为一个酶单位(unit)。)。v实际工作中,为保证消化完全,实际工作中,为保证消化完全,1ugDNA的消化需要的消化需要3-5个单位的酶,反应时间也要适度延长,通常是反应个单位的酶,反应时间也要适度延长,通常是反应过夜。过夜。本讲稿第八页,共二十一页酶切反应系统的设计酶切反应系统的设计v回收回
4、收DNA通常酶切通常酶切10gv实际酶的用量应是理论用量的实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。倍。v酶通常保存在酶通常保存在50%的甘油中的甘油中,使用时甘油浓度必须小,使用时甘油浓度必须小于于5%,故酶至少稀释,故酶至少稀释10倍。倍。vBuffer通常是通常是10,使用时稀释,使用时稀释1010倍。倍。v总反应体积总反应体积20-50ul20-50ul,不足用,不足用tdHtdH2 2O O补足。补足。本讲稿第九页,共二十一页DNA的量的量酶的用量(酶的用量(U/C)酶在酶在50甘油中,甘油在总甘油中,甘油在总体积的浓度要小于体积的浓度要小于5反应的总反应的总体积体积Buffer的体积的体
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