基因科学的革命———基因芯片技术.pdf
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1、 小 专 论基因科学的革命 基因芯片技术3翟 鹏 童坦君(北京医科大学生物化学与分子生物学系,北京100083)摘要 基因芯片技术是一种建立在杂交测序基本理论上的全新技术,它利用固定在芯片上的几万至几十万条探针与样品进行杂交,在一步实验中获取大量的信息。它的出现,使基因序列测定、基因功能测定等工作的程序得到了极大的简化,使许多原来根本不可能实现的检测成为可能。基因芯片技术使用了包括光控固相化学合成、激光共聚焦等在内的多项先进技术,实验实现了全部自动化,操作极为简便,可以节约大量的时间和实验成本。该项技术,已经在基因多态性分析、基因表达分析等多方面得到了广泛的应用,并已开始应用于临床诊断。随着基
2、因芯片技术的进一步成熟和越来越多的成品芯片的设计制造成功,该项技术必将在整个分子生物学领域掀起一场新的革命。关键词 基因芯片;杂交;光控固相化学合成;激光共聚焦学科分类号 Q75;Q81核酸杂交技术无疑是用于基因研究的最常用的工具,应用核酸杂交技术可以对基因的同源性以及其功能状态进行测定。但是,在分析复杂的基因网络,特别是要判明基因群的功能状态时,工作量十分庞大,传统的核酸杂交技术的效率就显得过于低下。随着人类基因组计划的逐步实施,基因组序列日趋明朗,下一步就是要确定各种不同基因的功能。这样,研究人员将面临前所未有的压力,因此,必须建立高效、准确、自动的遗传信息分析系统,基因芯片技术,于是应运
3、而生。基因芯片(又称DNA芯片、寡核苷酸芯片等)最早由E.Southern在1989年提出,而后立即受到了多方重视。基因芯片已经在基因表达分析、基因型判断等领域得到了广泛的应用,在临床上,基因芯片技术在判定疾病的发生、药物的疗效等方面也可以起到重要的作用。美国加州的Affymetrix公司(隶属于葛兰素制药公司)在其首席执行官兼总工程师Fodor的领导下,已经制出了商品化的基因芯片。本文所介绍的基因芯片的许多技术细节,多来自该公司的网页(http/:www.A)。一、基因芯片的制造基因芯片的制造,实际上就是将大量已知的探针,固定于选定的片基上,从而获得一高密度(通常探针的密度在65 00060
4、0 000/cm2)的探针阵列。在制作基因芯片前,首先,要根据所要测定的基因片断,确定可以与之杂交的探针阵列,而后,利用特殊的电脑程序,设计出用于合成该阵列的光刻底片(photolithographic masks),以便进行下一步的合成。基因芯片探针阵列的合成应用了一种被称为光控化学合成(light2directedchemicalsynthesis)的技术(图1),它3 国家自然科学基金重点项目资助课题(39930170)与国家重点基础研究发展规划资助项目(G1999053906)531生理科学进展2000年第31卷第2期 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optic
5、al Disc Co.,Ltd.All rights reserved.将固相化学合成(solid2phase chemical synthesis)和光刻技术有机的结合在了一起。首先,将支持物表面氨基化或羟基化,而后,用光敏保护基团将支持物表面的氨基保护起来,当光线(如紫外线)通过光刻底片照在支持物上时,在有光线通过的部分,保护基团脱去,表面的氨基被活化。氨基活化后,加入一端连有光敏保护基团、另一端预先被活化了的探针单体分子(核苷酸),于是,此单体分子就被连接到了支持物表面的氨基上。应用不同的光刻底片,可以使不同位点的氨基活化,加入不同的探针单体分子,就可以使支持物表面有序的固定上不同的探针
6、单体分子。重复以上步骤,可以使探针分子不断延长,直至获得所需探针。制作完成后,将其封图1 基因芯片的制作过程 通过光刻技术,将设计好的探针固定于芯 片的表面,从而获得一高密度的探针阵列装在工程塑料封装套中,工程塑料封装套不仅可以对芯片起保护作用,还可作为杂交时的容器。二、样品杂交和结果的分析样品在被测定前,首先要经过消化,使待测组织细胞中的DNA或RNA释放出来,在经过适当的扩增后,以荧光标记物标记,放入基因芯片自动孵育装置(Fluidics Station)中,由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件,进行杂交,这一过程,仅需要数秒钟。杂交完成后,要对基因芯片进行“读片”,即应
7、用激光共聚焦荧光扫描显微镜,对基因芯片表面的每个位点进行检测。这种显微镜,将聚焦的平面设定为芯片的表面,因此可以检测结合到芯片表面位点的样品片断的荧光标记,而待测样品中未与芯片上探针结合的荧光标记物,则悬浮于溶液中,由于不在聚焦平面上,因而不被检测。样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素,但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多,因此,通过对信号强度的分析,就可以区分正确与错误的配对。为了使结果的检验更加简便和快速,Affymetrix的基因芯片的分析系统中采用了基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站,对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析,仅需要数分钟的时间
8、。这样在短短的几十分钟至数小时内,就可以完成用传统方法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验。631生理科学进展2000年第31卷第2期 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.三、基因芯片技术的应用基因芯片技术在遗传学研究中具有不可比拟的优势,因此自其问世起就得到了广泛的应用,并被评为21世纪最有发展前途的20项高新技术之一。目前主要应用于以下三个领域:(一)基因表达分析 基因芯片具有高度的敏感性和特异性,它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交
9、技术不同,基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中,包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针(图2),这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。这种成对的探针可以将非特异性杂交和背景讯号减小到最低的水平,由此我们就可以确定那些低强度的mRNA。目前,Affymetrix公司已经生产出HugeneFL、图2 探针与待测基因杂交后的荧光显色图样 荧光显色的强度与探针与待测基因的匹配程度正相关,完全配对 的探针与样品杂交后所发出的荧光强度,较不完全配对的探针强Mu6500(含有小鼠6 500个基因)、Ye6100(含有酵母6 10
10、0个基因)等基因芯片成品。英国剑桥大学Whitehead研究所的Frank C.P.Holstege等人,应用含有酵母基因组的基因芯片,深入研究了真核细胞基因组的调节周期。应用基因组水平的表达分析,监测那些表达受转录起始机制的关键成分控制的基因,发现RNA聚合酶II、主要的转录因子TFIID和SAGA染色体修饰复合物等均在基因的表达中有自己特定的作用位点。通过本试验,研究人员揭示了:(1)基因特异性的转录因子对表达的调控作用。(2)细胞在缺乏营养的环境中,基因不同位点的协同调节作用的全新机制。(3)信号转导通路的最终作用位点,在最初的几步中就可以确定。以此试验为基础,研究人员进一步绘制出了酵母
11、基因组控制图,并由此分析出了各种调节因子在基因上不同的作用位点和其作用的分子机制。美国Stanford大学的V.R.Iyer等人,对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的基因进行了分析。首先,他们用成纤维细胞中的8 600个基因片断制成基因芯片的探针阵列,通过与mRNA反转录形成的cDNA的杂交反应,可以判断出该基因的活性。在试验中,成纤维细胞被置于无营养的环境中,使绝大部分基因的活性关闭,两天后,加入10%的血清,24小时内,分6个不同的时间点,观察基因的活化情况。试验结果表明,在所有被监测的基因中,约有500个基因最为活跃,而使细胞保持不分裂状态的基因活性被抑制。其中,最早被活化的是那些转
12、录调控基因。在活化的基因中,有28个基因共同作用,控制细胞的增殖;8个与免疫反应的激活有关;19个与血管重建有关;另有许多基因,与血管新生密切相关。在肿瘤细胞中,基因的表达与正常的细胞存在着明显的差异。美国Stanford大学的David Botstein利用cDNA731生理科学进展2000年第31卷第2期 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.微阵列芯片,对乳腺癌细胞的基因表达进行了分析,发现其基因表达水平明显低于正常细胞。利用基因芯片对表达进行分析,在一次试验中可以获取相当于在60余万次传
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