第二节动物细胞工程技术.ppt
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1、第二节动物细胞工程技术现在学习的是第1页,共56页思考与回忆:1 1、动物细胞全能性特点?、动物细胞全能性特点?随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制,分化潜能变窄。随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制,分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。细胞核仍具有全能性。2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体?成动物个体?不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中,伴随一定的组不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中,伴随一定的组织分化,不管采用什么手段和培养条件,由于细胞的运动、变化,织分化,不管采用什么手段和培养条件,由于细胞的运动、变化,细胞发生结构功能变
2、异,结果长时间的培养只能使单一类型的细细胞发生结构功能变异,结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来,最终成了简单的细胞培养。胞保存下来,最终成了简单的细胞培养。3、动物的细胞培养的理论依据(原理)?、动物的细胞培养的理论依据(原理)?细胞增殖细胞增殖现在学习的是第2页,共56页动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合动物动物细胞细胞工程工程主要主要技术技术其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植现在学习的是第3页,共56页现在学习的是第4页,共56页一、动物细胞培养的一、动物细胞培养的概念和原理概念和原理:1 1、概念:、概念:动物细胞
3、动物细胞培养就是从动物有机培养就是从动物有机体中取出相关的体中取出相关的组织组织,将它分散成将它分散成单个细胞单个细胞,然后然后,放在适宜的放在适宜的培培养基养基中中,让这些让这些细胞细胞生长和增殖生长和增殖.2、原理:、原理:细胞增殖细胞增殖现在学习的是第5页,共56页3 3.动物细胞培养的动物细胞培养的条件条件:1 1)营养:营养:4 4)气体环境:)气体环境:2 2)无菌无毒的环境:无菌无毒的环境:3 3)温度和)温度和pHpH:现在学习的是第6页,共56页条件条件:1 1)营养:营养:对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理;无菌处理;培养液中培养液中添加抗生素添加抗生素防
4、止培养过程中防止培养过程中污染;污染;定期更换培养液定期更换培养液以清除代谢产以清除代谢产物,防止对培养细胞造成危害。物,防止对培养细胞造成危害。2 2)无菌无无菌无毒的环境:毒的环境:液体合成培养基液体合成培养基:(:(糖、氨基酸)、糖、氨基酸)、促生长因子、(水、无机盐、微量元素)促生长因子、(水、无机盐、微量元素)等;通常还需加入等;通常还需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成天然成分。分。现在学习的是第7页,共56页条件条件:适宜的温度:适宜的温度:人和哺乳动物细胞人和哺乳动物细胞最适温度为最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度:适宜的酸碱度:PH:7.2-7.44 4)气体环境:)气体
5、环境:3 3)温度和)温度和pHpH:“95空气空气+5CO2”的混合的混合气体培养箱。气体培养箱。氧氧气是细胞代谢必须的;气是细胞代谢必须的;CO2维维持培养液的持培养液的PHPH。现在学习的是第8页,共56页问题问题1 1、动物血清的作用是动物血清的作用是什么什么?以以提供提供一个类似生物体一个类似生物体的的内环境内环境;此外动物此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶,血清中也包含了一些动物的激素和酶,可以可以促促进进细胞的细胞的发育发育。现在学习的是第9页,共56页胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理取出组织取出组织胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎剪碎单个细胞单个细胞细胞悬液细胞悬
6、液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养 原代培养原代培养4 4:过程:过程:图示图示原代培养原代培养现在学习的是第10页,共56页 定义:定义:人们通常将动物组织人们通常将动物组织消化后消化后的的初次初次培养培养称为原代培养。称为原代培养。原代原代培养培养4 4:过程:过程:现在学习的是第11页,共56页问题问题2 2、为什么选用动物为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料?做动物细胞培养材料?问题问题3 3、为什么在用酶处理前要先剪碎?、为什么在用酶处理前要先剪碎?因为其细胞生命力旺盛,分裂能力强,分化程度因为其细胞生命力旺盛,分裂能力强,分化程度低。
7、低。增大与酶的接触面积。增大与酶的接触面积。问题问题3 3、为什么培养前要将组织细胞为什么培养前要将组织细胞分散成单个分散成单个细细胞?胞?扩大细胞与培养液的接触面积,利与细胞吸收营扩大细胞与培养液的接触面积,利与细胞吸收营养。养。现在学习的是第12页,共56页问题问题5 5:为什么用为什么用胰蛋白酶胰蛋白酶处理?处理?(动物组织细胞间隙中含有一定量的(动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质弹性纤维等蛋白质,),)胰蛋白酶处理动物组织,可以使动物组织胰蛋白酶处理动物组织,可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解,细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解,获得单个细胞。获得单个细胞
8、。问题问题6 6:为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶?为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶?动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适PH值为值为7.2-7.4,胰蛋白,胰蛋白酶作用的适宜酶作用的适宜PH为为7.2-8.4,胃蛋白酶适宜,胃蛋白酶适宜PH为为2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在PH为为7.2-7.4的动物细胞培养中的动物细胞培养中无活性。无活性。现在学习的是第13页,共56页问题问题7 7:用胰蛋白酶处理用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉不会把所培养的细胞消化掉吗?吗?问题问题8 8、动物细胞培养动物细胞培养能否能否像绿色植物组织培养那样最终像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体培养成新个体?
9、控制好时间!长时间处理当然会损伤控制好时间!长时间处理当然会损伤细胞。细胞。不能,动物细胞培养只能使细胞数目增不能,动物细胞培养只能使细胞数目增多,不能发育成新的动物个体多,不能发育成新的动物个体现在学习的是第14页,共56页问题问题8、动物细胞培养液有哪两大特点?动物细胞培养液有哪两大特点?问题问题9 9、为什么会出现为什么会出现贴壁生长贴壁生长 1、贴壁生长、贴壁生长 2、接触抑制、接触抑制 大多数组织细胞不适应悬浮生长,必须在固定的表面大多数组织细胞不适应悬浮生长,必须在固定的表面上生长和分裂。上生长和分裂。问题问题1010、如何解除如何解除接触抑制接触抑制:传代培养传代培养现在学习的是
10、第15页,共56页强调一:强调一:细胞贴壁过程细胞贴壁过程细胞贴壁:细胞贴壁:在培养瓶悬液中分散的细胞很快就在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附贴附在瓶壁在瓶壁上,称为细胞贴壁。上,称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求:培养瓶或培养皿壁要求:表面光滑、无毒、易于帖表面光滑、无毒、易于帖附。附。现在学习的是第16页,共56页 当贴壁细胞分裂生长当贴壁细胞分裂生长到表面到表面相互接触相互接触时时,细胞就细胞就会会停止分裂停止分裂增殖,这种现增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。象称为细胞的接触抑制。强调二强调二:接触抑制:接触抑制现在学习的是第17页,共56页 定义:定义:当原代培养的细胞处于当原代培养的
11、细胞处于接触抑制后接触抑制后,用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理,使细胞从瓶壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离下下来来,然后加入新的培养液然后加入新的培养液,将细胞分离稀释将细胞分离稀释,并并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这这个过程称个过程称传代培养传代培养.(分瓶培养的过程分瓶培养的过程)细胞:细胞:分为分为细胞株细胞株和和细胞系细胞系 传代培养传代培养现在学习的是第18页,共56页问题问题1111、如何界定原代培养、传代培养?细胞株、细胞如何界定原代培养、传代培养?细胞株、细胞系?系?原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立
12、即进行培养,通常把第一代至第十代以内的培养后立即进行培养,通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养细胞统称为原代细胞培养;将原代培养的培养物分将原代培养的培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内,割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内,再进行培养,这个过程就称为传代培养。再进行培养,这个过程就称为传代培养。细胞分裂细胞分裂1050代为细胞株代为细胞株;分裂分裂50代以上极为代以上极为细胞系。细胞系。现在学习的是第19页,共56页细胞株:传代细胞一般能传到细胞株:传代细胞一般能传到40-5040-50代,代,遗传物质一般不会发生改变遗传物质一般不会发生改变,叫细
13、胞株。,叫细胞株。强调:细胞系、细胞株强调:细胞系、细胞株细胞系:传代细胞系:传代5050代以后不能再传下去,部代以后不能再传下去,部分细胞分细胞遗传物质发生了改变遗传物质发生了改变,能连续传代,能连续传代,获得不死性,叫细胞系。获得不死性,叫细胞系。现在学习的是第20页,共56页5 5、总结:动物细胞、总结:动物细胞培养过程培养过程动物胚胎或幼龄动物的组动物胚胎或幼龄动物的组织、器官织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理剪碎用胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶40-5040-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液稀释加培养液稀释
14、传代传代1010代以内,代以内,遗传物质不改变,保遗传物质不改变,保持持正常正常二倍体核型二倍体核型。传代传代10-5010-50代左右,增长缓慢以至于代左右,增长缓慢以至于完全停止,完全停止,部分细胞核型可能发生部分细胞核型可能发生变化变化(遗传物质可能改变(遗传物质可能改变)为什么用胰蛋白酶处理?为什么用胰蛋白酶处理?分瓶分瓶传代培养传代培养原代培养特点:原代培养特点:细胞贴壁、接触细胞贴壁、接触抑制抑制继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不死性获得不死性,细胞突变细胞突变,遗传物质已经改变遗传物质已经改变,等等同于癌细胞同于癌细胞。细细胞胞株株:一一般般说说遗遗传传物物质质未
15、未改改变变细细胞胞系系:遗遗传传物物质质已已改改变变原原代代培培养养现在学习的是第21页,共56页6 6.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用:1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3.3.检测有毒物质,判断某种物质的毒性检测有毒物质,判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 现在学习的是第22页,共56页植物组织培养和动物细胞培养的比较:植物组织培养和动物细胞
16、培养的比较:比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 促促-动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系培养目的培养目的快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株病毒植株获得细胞或细胞获得细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白取材取材植物幼嫩部分或花植物幼嫩部分或花药药胚胎或幼龄动物胚胎或幼龄动物的器官或组织的器官或组织其他条件其他条件无菌无毒,适宜条无菌无毒,适宜条件件无菌无毒,适宜
17、无菌无毒,适宜条件条件现在学习的是第23页,共56页现在学习的是第24页,共56页人鼠细胞融合过程现在学习的是第25页,共56页1 1、定义:、定义:指用自然或人工方法使指用自然或人工方法使两个或多个不两个或多个不同的细胞融合成一个同的细胞融合成一个细胞的过程。细胞的过程。一)、动物细胞融合一)、动物细胞融合细胞杂交:细胞杂交:不同基因型的细胞之间的融合就是不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交细胞杂交。杂交细胞:杂交细胞:融合后形成的具有原来融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息两个或多个细胞遗传信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细胞成为杂交细胞。现在学习的是第26页,共56页 细胞融合是
18、正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用现在学习的是第27页,共56页动物细动物细胞融合胞融合现在学习的是第28页,共56页2、诱导融合的诱导融合的方法方法 物理法:物理法:电激电激融合融合 化学法:化学法:聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融合诱导融合.生物法:生物法:灭活的病毒灭活的病毒诱导融合诱导融合.(.(动物细胞融合所特有的。动物细胞融合所特有的。这是由这是由于于病毒的外壳病毒的外壳磷脂与动物细胞磷脂与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。
19、合的功能。)病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞现在学习的是第29页,共56页问题:问题:为什么细胞融合过程中使用的病为什么细胞融合过程中使用的病 毒需要灭活?不灭活行吗?毒需要灭活?不灭活行吗?因为灭活的病毒因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。融合。若若不灭活不灭活则会则会感染细胞感染细胞,且,且不能诱导不能诱导细胞融合。细胞融合。现在学习的是第30页,共56页3 3、动
20、物细胞融合技术的应用、动物细胞融合技术的应用 意义:意义:细胞融合技术细胞融合技术突破了有性杂交的突破了有性杂交的局限局限,使远缘杂交成为可能。,使远缘杂交成为可能。主要用途:主要用途:利用杂交瘤技术,利用杂交瘤技术,制备单克隆制备单克隆抗体。抗体。现在学习的是第31页,共56页二):动物细胞融合的成功应用二):动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备现在学习的是第32页,共56页人们获得抗体的传统方法是什么人们获得抗体的传统方法是什么?将抗原注入动物体将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么?效率低,产量有限,
21、纯度低,动物抗体注入人体可能效率低,产量有限,纯度低,动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。产生严重的过敏反应。运用已学知识,设想怎样获得单一类型的抗体?运用已学知识,设想怎样获得单一类型的抗体?能否用单个能否用单个B B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢?产生单一类型的抗体呢?-B B淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。思考思考现在学习的是第33页,共56页单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖能力的和具有无限增殖能力的骨
22、髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起,融合在一起,形成杂交瘤细胞形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既既能在体外快速生长,能在体外快速生长,又又能持续分泌成分单一的特异性抗能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子,就是单克隆抗体。分子,就是单克隆抗体。米尔斯坦米尔斯坦(阿根廷阿根廷)和科勒和科勒(德国德国)因此在因此在19841984年获诺贝尔奖。年获诺贝尔奖。现在学习的是第34页,共56页杂交杂交杂交杂交 细胞细胞细胞细胞灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细
23、胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞经免疫经免疫经免疫经免疫的小鼠的小鼠的小鼠的小鼠提取提取杂交瘤杂交瘤杂交瘤杂交瘤细胞细胞细胞细胞第一次筛选第一次筛选第一次筛选第一次筛选用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基第二次筛选第二次筛选第二次筛选第二次筛选能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克
24、隆抗体提取单克隆抗体现在学习的是第35页,共56页问题:问题:1 1)、本过程利用了哪些)、本过程利用了哪些原理原理?免疫原理;免疫原理;细胞融合原理和动物细胞培养原理细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2)、为什么选用)、为什么选用小鼠小鼠骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞与B B细胞细胞融合?融合?同种生物的细胞没有免疫排斥反应;同种生物的细胞没有免疫排斥反应;融合成的杂交瘤细胞,继承了双亲细胞的融合成的杂交瘤细胞,继承了双亲细胞的遗传物质。遗传物质。(不仅具有(不仅具有B B细胞分泌抗体的能力,而细胞分泌抗体的能力,而且还有无限增殖的本领,因而可以获得大量单克隆且还有无限增殖的本领,因而可以获得大量单
25、克隆抗体)抗体)现在学习的是第36页,共56页3 3 3 3)、为何要进行)、为何要进行)、为何要进行)、为何要进行两次筛选两次筛选?4 4)、如何进行)、如何进行第第2 2次筛选次筛选?培养在多孔培养板上,培养在多孔培养板上,每孔只有一个每孔只有一个杂交瘤细胞。杂交瘤细胞。第第1 1次筛选次筛选得到得到杂交瘤细胞杂交瘤细胞(多种)。(多种)。第第2 2次筛选次筛选得到能得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。群。问题:问题:现在学习的是第37页,共56页 动物特异性动物特异性免疫免疫 分离分离B淋巴细胞(淋巴细胞(B););找到找到骨髓瘤细胞(骨髓瘤细胞(G)。注意)。
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- 第二 动物 细胞 工程技术
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