蛋白质组学ppt讲稿.ppt
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1、关于蛋白质组学PPT第一页,讲稿共二十七页哦前言前言蛋白质组学是当今生命科学的六大研究热点之一蛋白质组学是当今生命科学的六大研究热点之一人类基因组计划人类基因组计划(human genome project,HGP)工工作作目目标标:测测定定人人类类细细胞胞2323对对染染色色体体上上大大约约3 3 10109 9 bp bp 的的核核酸序列。酸序列。HGP1990HGP1990年正式启动,于年正式启动,于20012001年发表了人类基因组框架图。年发表了人类基因组框架图。后后基基因因组组时时代代,也也称称为为功功能能基基因因组组时时代代。蛋蛋白白质质组组的的研研究究成为后基因组计划的核心内容
2、之一。成为后基因组计划的核心内容之一。2001.22001.2,人类蛋白质组,人类蛋白质组(HUPO)(HUPO)成立。成立。第二页,讲稿共二十七页哦一、一、蛋白质组学研究的历史、背景和蛋白质组学研究的历史、背景和 相关概念:相关概念:(一)基因组、基因组学与后基因组计划:(一)基因组、基因组学与后基因组计划:基基因因组组(genome)(genome):细细胞胞或或生生物物体体的的一一套套完完整整的的单单倍倍体体遗遗传传物物质质,是是所所有有不不同同染染色色体体上上全全部部基基因因和和基基因因间的间的DNADNA的总和。的总和。基基因因组组学学(genomicsgenomics):是是研研究
3、究基基因因组组的的科科学学。包包括括遗遗传传图图(genetic genetic mapmap)、物物理理图图(physical physical mapmap)、序序列列图图(sequence sequence mapmap)和和基基因因图图(gene gene mapmap)构构建建方方法法等等。基基因因组组学学主主要要探探讨讨基基因因组组的的结结构构特特点点,也也称称为为结结构构基因组学基因组学(structural genomicsstructural genomics)。)。第三页,讲稿共二十七页哦后后基基因因组组计计划划(post-genome post-genome projec
4、t project):HGPHGP完完成成后后,人人们们又又提提出出了了进进一一步步的的探探索索计计划划,以以探探讨讨基基因因的的功功能能为为目目的的。研究内容也称为研究内容也称为功能基因组学功能基因组学。功能基因组学的研究角度:功能基因组学的研究角度:1 1基基因因组组多多样样性性的的研研究究:阐阐述述功功能能基基因因多多态态性性对对机机体体的的影响。影响。2 2比比较较基基因因组组以以及及功功能能缺缺失失突突变变的的研研究究:观观察察基基因因表表达达被被阻阻断断后后(基基因因敲敲除除)在在细细胞胞和和整整体体所所产产生生的的表表型型变化。变化。3 3药药物物基基因因组组学学研研究究:选选择
5、择药药物物起起效效、活活化化、排排泄泄等等相相关关过过程程的的候候选选基基因因进进行行研研究究,分分析析、确确定定基基因因序序列列的的变变异(突变)与药物的关系等。异(突变)与药物的关系等。4.4.基因组的表达及其调控:基因转录表达谱及其调控,蛋白基因组的表达及其调控:基因转录表达谱及其调控,蛋白质组研究,生物信息学的应用。质组研究,生物信息学的应用。第四页,讲稿共二十七页哦(二)(二)蛋白质组学蛋白质组学转转录录子子组组(transcriptome):一一个个细细胞胞在在特特定定生生理理或或者者病病理理状态下表达的所有种类的状态下表达的所有种类的mRNA。蛋蛋白白质质组组(proteomep
6、roteome)由由一一个个细细胞胞,一一个个组组织织或或一一种种生生物物的的基因组所表达的全部相应的蛋白质。基因组所表达的全部相应的蛋白质。蛋白质组是一个动态的概念蛋白质组是一个动态的概念。蛋蛋白白质质组组学学(Proteomics),它它是是以以细细胞胞内内全全部部蛋蛋白白质质的的存存在在及及其活动方式为研究对象。其活动方式为研究对象。蛋蛋白白质质组组学学研研究究的的开开展展是是生生命命科科学学研研究究进进入入后后基基因因组组时时代代的里程碑的里程碑 第五页,讲稿共二十七页哦二蛋白质组学研究的策略和范围:二蛋白质组学研究的策略和范围:(一)研究策略:(一)研究策略:竭泽法:采用高通量蛋白质
7、组研究技术分析生物体内近乎所竭泽法:采用高通量蛋白质组研究技术分析生物体内近乎所 有蛋白,是从大规模、系统性的角度看待蛋白质组学。有蛋白,是从大规模、系统性的角度看待蛋白质组学。功能法:研究不同时期细胞蛋白质组成的变化和在不同环境功能法:研究不同时期细胞蛋白质组成的变化和在不同环境 下的差异表达,以发现有差异蛋白质的种类为主要目标。下的差异表达,以发现有差异蛋白质的种类为主要目标。(二)(二)研究范围研究范围蛋白质的表达模式;蛋白质的表达模式;蛋白质翻译后修饰研究蛋白质翻译后修饰研究 ;大规模蛋白质之间的相互作用;作用网络和复合体组成分析大规模蛋白质之间的相互作用;作用网络和复合体组成分析 第
8、六页,讲稿共二十七页哦三三 蛋白质组学研究技术基本流程:蛋白质组学研究技术基本流程:生物信息学生物信息学样品制备样品制备双向电泳双向电泳图像捕获和分析图像捕获和分析斑点切取与酶解斑点切取与酶解质谱分析质谱分析数据搜索数据搜索LC/MS/MS第七页,讲稿共二十七页哦(一)蛋白质组研究中的样品的制备体系:(一)蛋白质组研究中的样品的制备体系:1蛋白质组样品的全息制备:蛋白质组样品的全息制备:策略:根据溶解性、在不同细胞器定位进行样品预分级。策略:根据溶解性、在不同细胞器定位进行样品预分级。注意:材料新鲜,低温、防污染、防降解和蛋白修饰注意:材料新鲜,低温、防污染、防降解和蛋白修饰 一般流程:一般流
9、程:长至长至80%80%密度的培养细胞(或均一的动植物组织样品),用预冷的密度的培养细胞(或均一的动植物组织样品),用预冷的PBSPBS缓冲液清洗三次以上缓冲液清洗三次以上 按按照照1 1 10106 6细细胞胞加加入入5050 L L裂裂解解液液(8 8 mol/Lmol/L尿尿素素,4%4%CHAPSCHAPS,40mmol/L Tris40mmol/L Tris,65mmol/L DTT65mmol/L DTT)超超声声处处理理,处处理理时时间间5s5s,间间歇歇10s10s,功功率率100120W100120W,直直至至溶溶液液澄澄清清无无粘稠物为止。粘稠物为止。4 4 C C,离心,
10、离心,25,000 25,000 g 1h1h取上清液测定蛋白质浓度,分装后取上清液测定蛋白质浓度,分装后-70-70 C C保存保存 第八页,讲稿共二十七页哦2亚细胞蛋白质组样品制备:亚细胞蛋白质组样品制备:亚细胞蛋白质组学亚细胞蛋白质组学(subcellular proteomicssubcellular proteomics):针对细胞不同区域):针对细胞不同区域的蛋白质组学研究的蛋白质组学研究,如特定细胞器、多蛋白复合体等如特定细胞器、多蛋白复合体等亚细胞蛋白质组学的技术:亚细胞组分的分离纯化技术和蛋白亚细胞蛋白质组学的技术:亚细胞组分的分离纯化技术和蛋白质组技术两大方面。质组技术两大
11、方面。亚细胞器分离:差速离心法亚细胞器分离:差速离心法 +蔗糖密度梯度离心法蔗糖密度梯度离心法 自由流电泳技术自由流电泳技术 其它分子细胞生物学技术其它分子细胞生物学技术 多蛋白组合体的分离:免疫共沉淀法;亲和层析技术多蛋白组合体的分离:免疫共沉淀法;亲和层析技术 亚亚细细胞胞蛋蛋白白质质组组学学意意义义:富富集集低低丰丰度度蛋蛋白白;完完善善全全细细胞胞蛋蛋白白质质组组,提提供供蛋蛋白白质质的的亚亚细细胞胞定定位位信信息息;亚亚细细胞胞蛋蛋白白质质组组的的差差异异表表达达谱谱,可可灵灵敏敏地地反反映映出出病病理理因因素素造造成成的的蛋蛋白白质质的的量量变变、质质变变和和蛋蛋白白质质迁迁移移情
12、情况,在细胞生物学研究中表现出特殊的意义。况,在细胞生物学研究中表现出特殊的意义。第九页,讲稿共二十七页哦(二)(二)蛋白质组研究中蛋白质的分离技术:蛋白质组研究中蛋白质的分离技术:1双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-DE)分离技术:分离技术:原原理理:先先采采用用等等电电聚聚焦焦方方法法根根据据蛋蛋白白质质的的等等电电点点差差异异进进行行第第一一向向分分离离,再再根根据据蛋蛋白白质质分分子子量量的的大大小小进进行行SDS-PAGE第二向分离。第二向分离。分分辨辨率率:一一般般解解析析到到20003000个个蛋蛋白白质质点点,从从高高通通量量常常规凝胶多达规凝胶多达10000种蛋白质。种蛋白质。第
13、十页,讲稿共二十七页哦步骤:步骤:(1)一维等电聚焦电泳一维等电聚焦电泳(IEF)IEF IEF凝胶的制备:凝胶的制备:载体两性电解质载体两性电解质(sytheticcarrierampholyte,SCA)为介质为介质 固相固相pH梯度技术梯度技术(immobilizedpHgradient,IPG)加样加样:利用加样杯,边运行等电聚焦,边上样利用加样杯,边运行等电聚焦,边上样 将样品与重泡胀液混合,在将样品与重泡胀液混合,在IPG胶条泡胀的胶条泡胀的 同时样品也渗入胶条同时样品也渗入胶条 IEFIEF电泳电泳(2)二维二维SDS-PAGE:平衡平衡IEF胶,使一向胶上胶,使一向胶上的蛋白质
14、变性(的蛋白质变性(SDS);SDS-PAGE (3)染色染色(显色显色):根据具体条件选择根据具体条件选择IEFSDS-PAGE第十一页,讲稿共二十七页哦精度精度优点优点缺点缺点考马斯亮蓝考马斯亮蓝一般一般30100ng 最大最大810ng 操作简单,无毒,操作简单,无毒,背景及对比度好背景及对比度好染色时间长染色时间长灵敏度低灵敏度低银染银染 200pg 银染中醛类特异反银染中醛类特异反应,使凝胶酶切肽应,使凝胶酶切肽谱提取困难谱提取困难 灵敏度最高灵敏度最高 负染负染 100ng胶上蛋白回收率提胶上蛋白回收率提高高;透明背景透明背景 灵敏度不够灵敏度不够 荧光染色荧光染色 几个几个pg对
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