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1、项 士 学 位 论 文TIP30、EGFR 在HER-2阳性乳腺 癌中的表达及临床意义 The role of TIP30 and EGFR in HER-2-positive advanced breast _cancer and its clinical significance _导 师 姓 名 罗荣城教授专 业 名 称 肿 瘤 学培 养 类 型 学 木 型论 文 提 交 日 期 2014年3月18日 _TIP30、EGFR在HER-2阳性乳腺癌中的表达及临床意义The role of TIP30 and EGFR in HER-2-positive advanced breastcan
2、cer ana its clinical sigmiicance课题来源:广东省自然科学基金:编号10151051501000050学 位 申 请 人 导 师 姓 名 专 业 名 称 培 养 类 型 培 养 层 次 所 在 学 院 答辩委员会主席 答辩委员会委员李祺罗 荣 城 教 授 胂瘤学 学术型 颂士第一临床医学院王远东朱玲玲李荣张向群谢德荣王远东论 文 评 阅 人 马 东李 爱 民2014年 3月 18日 广 州TIP30、EGFR 在HER-2阳性乳腺癌中的表达及临床意义硕士研究生:李祺指导老师:罗荣城教授摘要背景:乳腺癌在女性恶性肿瘤中最为常见,其发病率呈逐年上升趋势,为女性癌 症死
3、亡原因的第二位,严重威胁女性的生命健康和生活质量。在这些患者中, 约25%30%的乳腺癌患者伴有HER-2的过度表达,她们往往表现为易发生淋巴 结转移,对内分泌治疗相对耐药,化疗缓解期缩短,预后比HER-2阴性患者差。 曲妥珠单抗(赫赛汀,Herceptin )是种人源化的针对人表皮生长因子受体 -2( HER-2)膜外部分的单克隆抗体,它显著改善了HER-2阳性患者的治疗效果, 但并不是所有HER-2阳性的患者应用曲妥珠单抗均有效。在HER-2阳性乳腺癌患 者的新辅助、補助、姑息治疗阶段均可能出现分子靶向药物治疗耐药的现象。 因此,寻找有效的曲妥珠单抗治疗HER-2阳性乳腺癌疗效预测指标具有
4、重要意 义。TIP30/CC3 ( Tat-interactive protein 30),是上世纪末Shtivelman等研究人员应 用RNA 差异显示技术发现它高表达于转移性低的小細胞肺癌細胞系,相反在转 移性高的小細胞肺癌細胞系它多为阴性表达,据此人们推测其与肿瘤转移抑制 相关。随后发现TIP30/CC:3可以通过HIV (human immunodeficiency virus)转录辅 助因子Tat 蛋白的结合来调控Tat 蛋白的转录功能,使 HIV的増殖能力提高,所以 也称HITAP2(HIV-1 Tatinteraetiveprotein2)。近年来国内外多项研究发现它在 肺癌、胃
5、癌、肝癌及肠癌等多种癌组织中表现为低表达甚至缺失。敲除TIP30基因的小鼠可以自发性形成肝癌、膀胱癌及乳腺癌等多种肿瘤。这些均提示TIP30 是种抑癌基因。研究发现TIP30抑制肿瘤发生与发展的机制包括减慢肿瘤細胞 的生长速度、诱导肿瘤細胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成、调控DNA的损伤及 修复、増加肿瘤细胞对化疗的敏感性等。文献报道在乳腺癌细胞中,TIP30可以 与Tat蛋白、 RNA聚合酶II (RNA polymerase II) 起共同刺激HIV-1,并且活化 Tat蛋白的转录,共同参与多种细胞信号传导通路,调节抑癌基因P53的转录和抑 制ERa调节的c -myc等基因的转录。在对乳腺癌患
6、者进行TIP30表达与临床预后的 关系研究中,多数结果显示TIP30表达水平与脉管侵犯和腋窝淋巴结转移为负相 关,认为TIP30表达下调提示乳腺癌患者预后不良。部分实验发现TIP30基因表 达与HER-2表达呈正相关的关系,且TIP30基因和c-erbB -2基因参与调节细胞增殖 和分化的MAPK 通路和PI 3K/AKT通路的信号级联放大功能。这些提示我们TIP30 在乳腺癌的发生、发展中起重要作用,可能与乳腺癌的分子分型有关。EGFR (epidermal growth factor Receptor)是原癌基因 e-erbBl 的表达产物,与HER-2同 为表皮生长因子受体(HER)家族
7、成员之一。EGFR在肺癌、肠癌等多种实体肿 瘤中都存在高表达或异常表达情況,它可以与EGF等配体结合,激活下游的信号 传导通路如PI3K/AKT、MAPK/ERK等,调控肿瘤细胞的生长、分化、黏附和浸 润转移等多个过程。在对ft妥珠单抗耐药的研究中,有学者发现曲妥珠单抗联 合EGFR的酪氨酸激酶抑制剂,如吉非替尼(gefitinib)或埃罗替尼(erlotinib), 可使耐药細胞株生长受到抑制,提示EGFR表达上调与曲妥珠单抗耐药有关。在 肝癌和肺癌的研究中,肖华等发现TIP30可以通过调控EGFR细胞浆内转运,下 调EGFR下游信号通路的活性,抑制肿瘤发生、发展。目前TIP30与EGFR
8、在HER-2 过表达晩期乳腺癌中的相关性研究尚无报道,TIP30在乳腺癌发生、发展中的作 用机制尚未清楚,它是否也通过影响EGFR表达及其信号传导来发挥其生物学作 用,这些都有待我们进一歩研究证实。目 的 :1、观察TIP30在HER-2过度表达乳腺癌组织和HER-2阴性乳腺癌组织中蛋白表达的差异。_硕士学位论文 _2、 分析TIP30与HER-2过度表达乳腺癌患者临床病理特征(年龄、ECOGPS 评分、病理类型、转移部位数、ER/PR表达情况)、生物化疗近期疗效(无进展 生存期,PFS )之间的关系。3、 分析EGFR 与HER -2过度表达乳腺癌患者临床病理特征(年龄、ECOGPS 评分、
9、病理类型、转移部位数、ER/PR表达情況)、生物化疗近期疗效(无进展 生存期,PFS )之间的关系。4、 分析HER-2过表达乳腺癌中TIP30与EGFR的相关性。实验材料和方法:1. 实验材料 1.1研究对象筛选2006年10月至2009年11月南方医科大学附属南方医院诊治并符合 本研究条件的乳腺癌患者病理组织共53例,具备以下条件:(1)南方医院术后病理 诊断为原发性浸润性乳腺癌;(2)HER-2免疫组化检测+或FISH检测阳性;(3) 有完整的临床资料;(4)有可测量病灶;(5)生物化疗前未接受放疗和化疗;(6) 接受生物化疗(曲妥珠单抗联合紫杉醇)至少2个周期。另取49例HER-2阴性
10、乳 腺癌组织作为对照。1.2实验试剂兔抗人的TIP30多克隆抗体,兔抗人的EGFR单克隆抗体,辣根过氧化物酶 标记的山羊抗兔抗,苏木素,DAB显色剂,1%盐酸乙醇,95%乙醇,无水乙 醇等。2. 实验方法2.1 TIP30蛋白在乳腺癌组织中表达的检测采用免疫组织化学法检测53例HER-2过表达乳腺癌和49例对照组HER-2阴 性乳腺癌石蜡切片中TIP30表达情况。石蜡组织切片,脱蜡水合、用抗原修复、 血清封闭后滤干,添加TIP30抗体(稀释浓度1:50) , 4C过夜后,复温45min用 PBS冲洗,再加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗,室温下孵育lh 后,DAB 显色,苏木素复染2min,水洗
11、,脱水,中性树胶封片,镜下观察。采用半定量双盲法评分,Olympus光学显微镜高倍镜(400倍)下每张切片随机选取5个视野, 分别计数至少200个细胞。TIP30是以细胞质出现棕色颗粒为阳性染色。染色结 果用镜下观察的细胞显色程度及显色比例两项分值乘积统计。细胞显色程度: 无显色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,细胞显色比例:60%为3分。两项分值乘 积2分者判定为表达阳性,2分者为阴性表达。2.2 TIP30和EGFR蛋白在HER-2过度表达乳腺癌组织中表达的检测采用免疫组织化学法检测53例HER-2过表达乳腺癌石蜡切片中TIP30和 EGFR表达情况。石蜡组织切片,脱蜡水合
12、、抗原修复后滤干,添加TIP30抗体 或EGFR抗体(稀释浓度 1:50) , 4C过夜,复温 45min, PBS冲洗,加辣根过氧 化物酶标记的山羊抗兔抗,室温下孵育lh后,DAB 显色,苏木素复染2min, 水洗,脱水,中性树胶封片。采用半定量双盲法评分,显微镜高倍镜(400倍) 下每张切片随机选取5个视野,计数至少200个細胞。TIP30以细胞质出现棕色颗 粒为阳性染色。EGFR 以细胞膜上出现褐色颗粒为阳性染色。染色结果用细胞显 色程度及显色比例两项分值乘积统计,方法同2.1中TIP30免疫组织化学法检测。2.3 TEP30和EGFR蛋白表达与HER-2过表达晚期乳腺癌患者临床病理特征
13、及预后 之间的关系收集53例HER-2过表达晚期乳腺癌病人的临床资料,按照患者的年龄(50、 0. 001)。多因素分析则表明TIP30是HER-2过表达乳腺 癌患者PFS 的 独 立 预 测 因 素 。_ 摘 要4、TIP30和EGFR 两种蛋白在 HER-2过表达晚期乳腺癌组织中的表达相关性 53例HER-2过表达晚期乳腺癌组织中,TIP30的阳性率为56.6% (30/53), 而EGFR在HER -2过表达晩期乳腺癌中的表达阳性率26.4% (14/53)。采用 Spearman相关性分析, TIP30与EGFR 蛋白在HER-2过表达晚期乳腺癌组织中表达 相关系数为-0.339, P
14、 =0.013 (尸0.05),表明两者存在着负相关。结 论 :1. TIP30在HER-2过度表达乳腺癌组织和HER-2阴性乳腺癌组织中表达无 显著差异。2. TIP30在HER-2过表达晚期乳腺癌组织中表达与ECOG PS相关,与患者 年龄、病理类型、转移部位数以及ER、PR表达状态无关。3. 生物化疗后,TIP30表达阳性患者的临床获益率、中位无进展生存期 (Progression-free Survival,PFS )较阴性组有显著优势。提示TIP3 0蛋 白 在HER-2过表达晩期乳腺癌组织中表达上调,可能是曲妥珠单抗联合化疗的HER-2 过表达乳腺癌患者生物化疗疗效好的预测指标之一
15、。4. TIP30与EGFR在HER-2过表达晚期乳腺癌中的表达呈负相关,提示在 HER-2过表达晚期乳腺癌中TIP30蛋白表达可能与EGFR信号传导通路的调控 有一定的相关性。关键词:乳腺癌TIP30 EGFR HER-2 生 物 化 疗 疗 效 预 测The role of TIP30 and EGFR inHER-2-positive advanced breast cancer andits clinical significanceName: Li QiSupervisor: Luo RongchengABSTRACTBackgroundBreast cancer is the mo
16、st common malignancy in women. Its incidence increased year by year, accounting for female cancer mortality in second place, a serious threat to womens health. In breast cancer patients, about 25% to 30% of breast cancer patients with HER-2 overexpression, these patients are often expressed as prone
17、 to lymph node metastasis, relatively resistant to endocrine therapy,chemotherapy, remission shortened, poor prognosis than HER-2 negative patients. Trastuzumab (Herceptin) is a humanized against HER-2 monoclonal antibody portion of the outer membrane,which significantly improves therapeutic effect
18、in HER-2-positive breast cancer, but not all patients with HER-2-positive used trastuzumab effectively. Patients in the course of neoadjuvant, adjuvant chemotherapy, or palliative care with HER-2-positive breast cancer are likely to appear resistant molecular target therapy. Therefore, looking for e
19、ffective prognostic marker of HER-2-positive breast cancer with Herceptin therapy is of great significance.TEP30/CC3 (Tat-interactive protein 30) was a gene related to the inhibition of metastasis,which was found by Shtivelman etc. in 1997 by the techniques of differential display RNA. It aid not ex
20、press in high metastatic small cell lung cancer cell lines, while highly express in low metastatic small cell lxing cancer cell line. It can bina to transcription cofactor Tat protein and regulate its transcription, andpotentiate proliferation of human immunodeficiency virus (HIV) , so also called H
21、ITAP2 (HIV-1 Tatinteraetive protein 2) . At home and abroad in recent years, several studies have found it in low expression or even missing in lung cancer, gastric cancer, liver cancer, colon cancer and other malignant tumors. Knock out TIP30 gene, can make the mice spontaneous formation of liver c
22、ancer, bladder cancer and breast cancer and other tumors. These all indicated that TIP30 was a tumor suppressor gene. There were studies show that TEP30 can inhibit tumor occurrence and development by inhibiting tumor cell growth, promoting tumor cell apoptosis, inhibiting tumor angiogenesis, adjust
23、ing the DNA damage repair and increasing the sensitivity of tumor cells to chemotherapy. TIP30 stimulated HIV-1 together with Tat protein and RNA polymerase II and then activated the Tat protein transcription, took part in a variety of cell signaling pathways, adjusted the transcription of P53 and i
24、nhibited the transcription of c-myc which was adjusted by Era in breast cancer cells. Most of the results in the studies of relationship between TIP30 expression and the clinical outcomes of breast cancer patients showed that TIP30 expression is negatively related to the axillaiy lymph node metastas
25、is and vascular invasion, and down-regulation of TIP30 is associated with poor prognosis of breast cancer patients. The study found that TIP30 expression and HER-2 expression were positively correlated, and the TIP30 gene and HER-2 were involved in MAPK pathway and PI3K/AKT signal cascade amplificat
26、ion pathway which regulate cell proliferation and differentiation. These showed that TIP30 play an important role in the occurrence and development of breast cancer. Epidermal growth factor receptor (EGFR) was a proto-oncogene expression product of c-erbBl, which was one of epidermal growth factor r
27、eceptor (HER) family members as HER-2. EGFR had a high expression or abnormal situation in lung cancer, colon cancer and other solid tumors. It can activate the downstream signaling pathways including MAPK/ERK and PI3K/AKT,combined with EGF and other ligands, and thus mediated tumor cell differentiation, growth, adhesion and cell migration, invasion and damage repair. Trastuzumab and EGFR tyrosine kinase inhibitors such as erlotinib (erlotinib) or gefitinib (gefitimb), were used together to inhibit growth of trastuzumab resistant cells, suggesting that EGFR upregulated was
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