第六章工业微生物育种.ppt
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1、第六章工业微生物育种现在学习的是第1页,共43页诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,在促进其突变频率显著提高的基础上,从中挑选少数符合目的的突变株,以供科学实验或生产实践使用。现在学习的是第2页,共43页 效价:指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)100250500 850 8508000 2万 5万510万 从青霉素产量看诱变育种现在学习的是第3页,共43页诱变育种目的提高有效产物的产量改变菌种特性,提高产品质量简化工艺条件开发新品种现在学习的是第4页,共43页诱变育种的
2、过程 选择合适的出发菌株选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液制备待处理的菌悬液 诱变处理诱变处理 筛选筛选 保藏和扩大试验保藏和扩大试验现在学习的是第5页,共43页 一、诱变育种的实验准备一、诱变育种的实验准备(一)诱变前对出发菌株的了解(一)诱变前对出发菌株的了解1 1、区分不同菌落类型、区分不同菌落类型2 2、出现不同菌落类型原因、出现不同菌落类型原因出发菌株现在学习的是第6页,共43页(二)全面了解菌种特性和生产性能的关系(三)了解影响菌种生长发育的主要因素1、培养基2、斜面培养基的制备技术3、接种量4、温度5、湿度6、药品和原材料质量现在学习的是第7页,共43页(四)了解菌种有效产物
3、中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系(五)建立一个准确、简便、快速检测产物的方法(六)研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件现在学习的是第8页,共43页二、诱变育种的步骤及方法(一)选择合适的出发菌株(一)选择合适的出发菌株1、对一般菌株的要求野生菌株对诱变剂敏感野生菌株对诱变剂敏感最好选用来自最好选用来自生产中生产中的自发突变菌株。的自发突变菌株。具有有利性状(如高产、生长速度快、营具有有利性状(如高产、生长速度快、营养要求粗放、标记明显等);养要求粗放、标记明显等);可选用已发生过其他突变的菌株。可选用已发生过其他突变的菌株。现在学习的是第9页,共43页 2、选择具有一定生产能力或某种
4、特性的菌株作为出发菌株3、选择纯种做出发菌株4、选择出发菌株应考虑其稳定性5、连续诱变育种过程中如何选择出发菌株6、采用多出发菌株7、了解菌种代谢特点现在学习的是第10页,共43页(三)制备待处理的菌悬液 1 1、选用单细胞或单孢子悬液(均匀、分散)、选用单细胞或单孢子悬液(均匀、分散)目的:目的:使每个细胞能均匀接触诱变剂;使每个细胞能均匀接触诱变剂;减少表型延迟现象(诱变后性状的分离及退减少表型延迟现象(诱变后性状的分离及退化现象)化现象)同步培养同步培养(生理状态一致)(生理状态一致)菌龄:对诱变剂最敏感时期菌龄:对诱变剂最敏感时期 营养细胞营养细胞:对数期:对数期 孢子或芽孢孢子或芽孢
5、:萌发前期:萌发前期现在学习的是第11页,共43页菌悬液的制备方法菌悬液的制备方法 物理诱变:生理盐水配制物理诱变:生理盐水配制 化学诱变:缓冲液配制化学诱变:缓冲液配制菌悬液的浓度菌悬液的浓度 酵母菌,霉菌的孢子:酵母菌,霉菌的孢子:10106 6个个/mL /mL 细菌,放线菌孢子:细菌,放线菌孢子:10108 8个个/mL/mL 不产孢子真菌:采用幼龄菌丝,三种方法制。不产孢子真菌:采用幼龄菌丝,三种方法制。制备原生质体作为诱变材料。制备原生质体作为诱变材料。现在学习的是第12页,共43页1.诱变剂的选择(高效,简便)诱变剂的选择(高效,简便)物理诱变剂:频度低、大损伤,难修复,且操作简
6、便;物理诱变剂:频度低、大损伤,难修复,且操作简便;化学诱变剂:频度高,点突变,易回复突变,操作麻烦。化学诱变剂:频度高,点突变,易回复突变,操作麻烦。(NTG(NTG超诱变剂)超诱变剂)UVUV是最常用的一种诱变剂是最常用的一种诱变剂(四)诱变剂的选择及处理方法(四)诱变剂的选择及处理方法2 2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂3 3、参考出发菌株原有的诱变谱系来选择诱变剂、参考出发菌株原有的诱变谱系来选择诱变剂现在学习的是第13页,共43页常以杀菌率来表示相对剂量(剂量-存活率曲线)最适剂量:最适剂量:既能扩大变异幅度,又能使变异向正既能扩大变异幅
7、度,又能使变异向正突变范围移动的剂量。突变范围移动的剂量。(P103)P103)突变率随剂量的增加而提高,达一定程度后,再提突变率随剂量的增加而提高,达一定程度后,再提高剂量高剂量,反而会使突变率下降。反而会使突变率下降。正变较多出现在偏低剂量中,而负变较多出现在偏正变较多出现在偏低剂量中,而负变较多出现在偏高剂量中。高剂量中。常采用相对杀菌率为常采用相对杀菌率为70-75%70-75%。4.4.剂量的选择剂量的选择现在学习的是第14页,共43页(五)(五)诱变处理方法诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理:单因素处理或多因素的复合处理:同一诱变剂的重复使用;同一诱变剂的重复使用;两种或多种
8、诱变剂的先后使用;两种或多种诱变剂的先后使用;两种或多种诱变剂的同时使用;两种或多种诱变剂的同时使用;紫外线光复活交替处理紫外线光复活交替处理诱变剂处理时间与诱变效应的关系诱变剂处理时间与诱变效应的关系现在学习的是第15页,共43页(六)影响突变率的因素(六)影响突变率的因素1 1、菌种遗传特性不同、菌种遗传特性不同2 2、菌体细胞壁结构不同、菌体细胞壁结构不同3 3、环境条件的影响、环境条件的影响1 1)诱变前预培养)诱变前预培养2 2)温度、)温度、pHpH、氧气等外界条件对诱变效、氧气等外界条件对诱变效应的影响应的影响3 3)菌落密度效应)菌落密度效应现在学习的是第16页,共43页表型延
9、迟表型延迟(phenotypic lag):表型的改变落后于基因型改变的表型的改变落后于基因型改变的 现象现象.分离性延迟:分离性延迟:突变的基因经突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯复制和细胞分裂后变成纯 合状态,表型才能表现出来合状态,表型才能表现出来。生理性延迟:生理性延迟:由杂合状态变为纯合状态,突变表型仍不能由杂合状态变为纯合状态,突变表型仍不能 表现出来。表现出来。分离性延迟的原因分离性延迟的原因:对数生长期中,对数生长期中,单核细胞常出现双单核细胞常出现双核现象核现象,多核细胞的核也成倍增加,诱变对数期的,多核细胞的核也成倍增加,诱变对数期的细胞时,突变通常发生在一个核上,故
10、其变异或细胞时,突变通常发生在一个核上,故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离,非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离,这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。现象。生理性延迟的原因生理性延迟的原因:当变异细胞由杂合状态变为纯合当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时状态时,由于杂合期所合成的非变异的由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶蛋白或酶仍然仍然发挥作用发挥作用,必须经过细胞多代分离后必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变才能将这些非变异的酶稀释掉异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态最终达到变异后应该表现的形态,如如营养缺
11、陷型突变株的筛选过程。营养缺陷型突变株的筛选过程。(四)(四)中间培养(中间培养(CMCM,培养过夜),培养过夜)目的:克服表型延迟目的:克服表型延迟现在学习的是第17页,共43页 初筛初筛 复筛复筛1.1.初筛(以量为主)初筛(以量为主)(1 1)利用形态变异)利用形态变异:需预先测定形态与产量的相:需预先测定形态与产量的相关性关性(2 2)根据平板颜色反应直接挑选)根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法(蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶);透明圈法(蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶);抑菌圈法(抗生素);抑菌圈法(抗生素);变色圈法(柠檬酸)、显色圈(氨基酸);变色圈法(柠檬酸)、显色圈(氨基酸);沉淀圈法(
12、外毒素沉淀圈法(外毒素透明圈直径(透明圈直径(H H)/菌落直径(菌落直径(C C):产量高低(初筛):产量高低(初筛指标)指标)方法需简便、快速2步步(五)突变株的筛选(五)突变株的筛选现在学习的是第18页,共43页(3 3)浓度梯度法)浓度梯度法(4 4)影印平板法)影印平板法(5 5)琼脂块大通量筛选方法)琼脂块大通量筛选方法现在学习的是第19页,共43页2.2.复筛(以质为主,定量测定)复筛(以质为主,定量测定)(1 1)摇瓶培养,直接检测所需产物)摇瓶培养,直接检测所需产物(2 2)产物活性检查)产物活性检查琼脂平板活性圈法琼脂平板活性圈法纸片法纸片法琼脂薄层纸片法琼脂薄层纸片法(3
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