《色谱基础理论》PPT课件.ppt
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1、福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrument Fuli instrument Chromatograph精诚为福,创新为立2014-3-22色谱基础理色谱基础理论论林直宏林直宏EmailEmail:福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph目录二二 气相色谱仪的结构与检测器原理气相色谱仪的结构与检测器原理一 色谱法的基本理论色谱法的基本理论三三 高效气相色谱仪的结构与原理高效气相色谱仪的结构与原理福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli ins
2、trumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph一、色谱法的基本理论一、色谱法的基本理论80%-85%的有的有机化合物机化合物福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph色谱法的起源色谱法的起源 20 20世纪初,俄国科学家茨维()提出经典世纪初,俄国科学家茨维()提出经典液相色谱法后,色谱分析法取得了迅速的发液相色谱法后,色谱分析法取得了迅速的发展,展,福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Ful
3、i instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph分离基本模型分离基本模型 ABCD流动相流动相3 3种组分同时进入色谱柱种组分同时进入色谱柱3 3种组分开始在色谱柱中分种组分开始在色谱柱中分离离3 3种组分在色谱柱中基本达种组分在色谱柱中基本达到分离到分离3 3种组分在色谱柱中完全达种组分在色谱柱中完全达到分离到分离色谱法,色谱法,即利用组分在体系中固定相与流动相的分配差异,将混合物组分进行分离和测定的方法。福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N
4、:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph色谱分类色谱分类GC进样方式:样品转化为液体流动相:惰性气体,不予组分发生反应,黏度10-5Pas,输出压力。固定相:1、分离机理:吸附、分配、络合、手性作用2、色谱柱:填充(粒度,柱内径1-4mm,柱长1-4m,柱效102-103;毛细(内径,柱长10-100m,柱效103-104);柱温室温-420。检测器:FID、TCD、ECD、FPD、NPD应用范围:低分子量、低沸点有机化合物;永久气体。LC进样方式:样品需为液体流动相:离子型、极性、弱极性或非极性溶液,可与被分析组分发生反应,黏度10-3Pas,输出压力45MPa。
5、固定相:1、分离机理:吸附、分配、筛析、离子交换、亲和、手性作用。2、色谱柱:填充(粒度5-10um,柱内径3-6mm,柱长10-25cm,柱效104;柱温室温-50。检测器:UVD、DAD、FD(荧光)、ECD(电导)、RID、ELSD应用范围:低分子量、部分低沸点、高沸点、高分子量有机化合物;离子型化合物;生物活性物质。福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph基本术语基本术语v 色谱图色谱图检测信号和时间的关系图检测信号和时间的关系图不同的色谱峰对应相应的组分
6、不同的色谱峰对应相应的组分可以得到相应组分的保留时间和峰面积信息。可以得到相应组分的保留时间和峰面积信息。保留时间保留时间 定性分析定性分析 峰面积峰面积 定量分析定量分析福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph 基本术语基本术语 保留时间(保留时间(Retention time):组份从进样到出现最大值所需要的时间组份从进样到出现最大值所需要的时间,tR死时间死时间(dead time):不被固定相滞留的组份,从进样到出峰最大值所需要的时间不被固定相滞留的组份,
7、从进样到出峰最大值所需要的时间,t0峰高(峰高(Peak Heigh)从峰最大值到峰底的距离从峰最大值到峰底的距离,峰面积(峰面积(Peak Area)峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph出峰异常出峰异常-无峰或峰很小无峰或峰很小GCA.A.色谱柱连接是否正确色谱柱连接是否正确B.B.系统是否有漏系统是否有漏C.C.检测器是否工作开启,如检测器是否工作开启,如FIDFID点火了点火了吗?吗?FIDFID高压静电正常吗?高压静
8、电正常吗?TCDTCD加电加电流了吗流了吗 D.D.柱中是否有载气柱中是否有载气E.E.样品是否降解、沉淀样品是否降解、沉淀LCA.A.色谱柱连接是否正确色谱柱连接是否正确B.B.系统是否有漏系统是否有漏C.C.检测器是否正常,如检测器是否正常,如UVDUVD的是否能力的是否能力异常,异常,R/SR/S是否正常;氘灯是否点亮是否正常;氘灯是否点亮D.D.流动相组分、纯度、配比是否正常流动相组分、纯度、配比是否正常E.E.样品是否降解、沉淀样品是否降解、沉淀福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新
9、为立 Chromatograph基线基线(base line)(base line)基线基线(base line)(base line)经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。一般应平行于时间轴。噪音噪音(noise)(noise)基线信号的波动。流动相波动、电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、基线信号的波动。流动相波动、电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、色谱柱被污染所致。色谱柱被污染所致。漂移漂移(drift)(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、
10、流动相及流量的基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph基线异常基线异常-噪声、漂移变大或不规则噪声、漂移变大或不规则GC流动相:载气不纯气源输出不稳气路有漏气检测器被污染色谱柱被污染LC流动相:流动相非色谱纯,使用试剂、水或药品不纯,或被污染;有气泡泵输液不稳检测器故障,如流过
11、池漏液色谱柱被污染福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph分离度(分离度(Resolution)Resolution)当当R=1 时,有时,有5的重叠;的重叠;当当时,分离程度为时,分离程度为99.7%,可视为基线分离,可视为基线分离 毛细管毛细管色谱柱色谱柱比填充比填充柱柱有更高的分辨率。有更高的分辨率。两个相邻峰的分离程度。两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表其平均半峰宽值的比来表示:示:福福立立仪仪器器福福
12、立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph峰的形状峰的形状理想的峰型是高斯曲线理想的峰型是高斯曲线.分子的理论统计学分布分子的理论统计学分布福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph拖尾因子拖尾因子(tailing factor(tailing factor,T)T)用以衡量色谱峰的对称性。用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子也称为对称因子(symmetr
13、yfactor)(symmetryfactor)或不对称因子或不对称因子(asymmetryfactor)(asymmetryfactor)。中国药典中国药典规定规定T T应为。应为。T T为前延峰,为前延峰,T T为拖尾峰。为拖尾峰。福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph峰型异常峰型异常-前伸峰前伸峰GC峰伸舌多为色谱柱过载,减小进样量,使用大容量柱子提高OVEN,INJ温度;进样技巧提高。色谱柱的连接LC死体积太大样品溶液的配比极性与流动相的极性相差太大。减
14、少进样量;保护柱或柱失效福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph峰型异常峰型异常-峰拖尾峰拖尾GC溶剂/固定相极性不相匹配色谱柱安装不正确同时有两个峰流出分流比太小LC色谱柱被污染或失效进样阀漏液福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph峰型异常峰型异常-峰开叉峰开叉GC进样口污染色谱柱被污染样品被污染,混入难分离杂质检测器被污染LC保
15、护柱污染柱失效样品被污染,混入难分离杂质福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph分配系数分配系数(distribution coefficient(distribution coefficient,K)K)在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。质有关
16、,也与温度、压力有关。混合物中各组混合物中各组分的分配系数相差越大,越容易分分的分配系数相差越大,越容易分LC:流动相(组分比例、流动相(组分比例、pH)、流速、进样量)、流速、进样量GC:流速、温度、进样量流速、温度、进样量福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph峰展宽的度量峰展宽的度量.以塔板数来表示以塔板数来表示类似蒸馏中的气液平衡类似蒸馏中的气液平衡柱效(柱效(Column EfficiencyColumn Efficiency)例如,图示中塔板数为例如,
17、图示中塔板数为3.3.塔板理论塔板理论理论塔板数为理论塔板数为:n=5.54(tR/W1/2)2 福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph速率方程速率方程气相色谱速率方程气相色谱速率方程(Van Deemter方程)方程)液相色谱速率方程液相色谱速率方程(即(即Giddings方程)方程)A B C A B C福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chrom
18、atographvan Deemter曲线曲线(颗粒度和柱床填装的优良程度)(颗粒度和柱床填装的优良程度)Height Equivalent to Theoretical Plate线速度线速度 U(mm/sec)HETP最低最低HETP=最优化的塔板数最优化的塔板数H(传质)(传质)(纵向扩散)(纵向扩散)HETP PLATES福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph影响色谱柱效率的因素影响色谱柱效率的因素A.A.涡流扩散涡流扩散(不同路径的影响不同路径的影响)
19、.采用细而均匀的载体,这样有助于提高柱效采用细而均匀的载体,这样有助于提高柱效 毛细管毛细管柱柱可忽略该项可忽略该项A2dp,dp为填料直径,为填料直径,为填充不规则为填充不规则因子,填充越不均匀因子,填充越不均匀越大。越大。福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph对于对于HPLCHPLC来说来说颗粒度越小柱效越高颗粒度越小柱效越高颗粒度控制着分离的质量颗粒度控制着分离的质量更小的颗粒度:更小的颗粒度:使最高柱效点向更高线速度使最高柱效点向更高线速度方向移动方向移
20、动有更宽的线速度范围有更宽的线速度范围降低颗粒度不但可以降低颗粒度不但可以增加柱效,同时也增增加柱效,同时也增加分离速度加分离速度van Deemter 曲线的挑战曲线的挑战如果填料的颗粒继续演变如果填料的颗粒继续演变福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 ChromatographHPLCHPLC(高效液相色谱法)(高效液相色谱法)填料颗粒尺寸的演变填料颗粒尺寸的演变如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况?如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况?10 min从从80年代到现在年代
21、到现在1.55m球形微多孔填料球形微多孔填料15004000 psi50,00080,000塔板数塔板数/米米3.9300mm70年代末期年代末期10m不规则微多孔填料不规则微多孔填料10002500 psi25,000塔板数塔板数/米米3.9300mm10 min70年代早期年代早期40m薄壳非多孔基质上涂布薄壳非多孔基质上涂布100500 psi1000塔板数塔板数/米米1m长色谱柱长色谱柱10 min福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph被仪器及色谱柱被仪
22、器及色谱柱被仪器及色谱柱被仪器及色谱柱的耐压的所限制的耐压的所限制的耐压的所限制的耐压的所限制福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrumentFuli instrumentL.I.N:2014-03-22精诚为福,创新为立 Chromatograph影响色谱柱效率的因素影响色谱柱效率的因素B.纵向扩散纵向扩散.气相中分子的扩散气相中分子的扩散 主要决定于气体流速主要决定于气体流速由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度,由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度,导致轴向扩散而引起的峰展宽。导致轴向扩散而引起的峰展宽。B/u2Dm/u。u为流动相线速度,分子在柱内的滞留时间越长(为流动相
23、线速度,分子在柱内的滞留时间越长(u小),展宽越严重。小),展宽越严重。Dm为分子在流动相中的扩散系数,由于液相的为分子在流动相中的扩散系数,由于液相的Dm很小,通常仅为气相的很小,通常仅为气相的10-410-5,因此在,因此在HPLC中,中,只要流速不太低的话,这一项可以忽略不计。只要流速不太低的话,这一项可以忽略不计。是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散,而引入的柱参数,用以对散,而引入的柱参数,用以对Dm进行校正。进行校正。一般一般在左右,毛细管柱的在左右,毛细管柱的1。福福立立仪仪器器福福立立仪仪器器 Fuli instrument
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