传代培养和细胞计数.ppt
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1、细胞传代培养及细胞计数人癌细胞系传代培养 1.1.观察:观察:培养细胞生长活跃,占瓶底培养细胞生长活跃,占瓶底80%-90%80%-90%,无污染;,无污染;2.2.弃废液:弃废液:倒掉瓶中培养液,尽量沥干液体;倒掉瓶中培养液,尽量沥干液体;3.3.漂漂洗洗:加加1ml1ml 0.25%0.25%胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化液液漂漂洗洗1 1次次,弃弃去去消消化液;化液;4.4.消消化化:再再加加1ml1ml消消化化液液漂漂洗洗1 1次次,倒倒掉掉大大部部分分消消化化液液,保留约保留约,室温放置室温放置3 35min5min;5.5.吹吹打打:镜镜下下看看到到细细胞胞收收缩缩变变园园,加加1 12
2、ml2ml含含血血清清培培养养液液,用吸管按顺序轻轻吹打,避免出现泡沫;用吸管按顺序轻轻吹打,避免出现泡沫;6.6.计数:计数:取样取样,计数计数,调整细胞浓度;调整细胞浓度;7.7.接接种种及及培培养养:按按10104 4 细细胞胞/ml/ml接接种种,37,37、5%CO5%CO2 2 ,饱饱和湿度条件下培养。和湿度条件下培养。注意事项 细细胞胞生生长长至至覆覆盖盖培培养养瓶瓶底底面面积积80%80%左左右右时时,开始传代。开始传代。首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。细胞混杂生长时细胞混杂生长时,可根据需要选择合适可根据需要选择合适的方法纯化细胞。的方
3、法纯化细胞。血球计数板法制备细胞悬液:制备细胞悬液:细胞密度细胞密度10104 4/ml,/ml,细胞细胞过多时需适当稀释过多时需适当稀释,单个细胞率单个细胞率95%95%。加样:加样:混悬细胞,取少许细胞悬液,从混悬细胞,取少许细胞悬液,从计数池一侧加入,不要溢出或出现气泡。计数池一侧加入,不要溢出或出现气泡。计数:计数:1010倍物镜下计数四角大方格内的倍物镜下计数四角大方格内的细胞,压线者只计左边线和上边线。细胞,压线者只计左边线和上边线。计算:计算:细胞数细胞数/ml=/ml=(四大格细胞总数(四大格细胞总数4 4)10104 4稀释倍数稀释倍数细胞活力测定台盼蓝染色法制备单个细胞悬液
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